苜蓿假盘菌与苜蓿叶片亲和性互作的超微结构特征

史娟，王华荣，钟少林

（1.宁夏大学农学院，宁夏 银川750021；2.西部土地退化与生态恢复国家重点实验室培育基地，宁夏 银川750021）

植物病原真菌引起寄主植物生病进而表现出症状，首先必须侵入寄主组织并在其体内生长，才能完成其侵染过程。因此，病原菌为了成功侵入发展了一系列的入侵及最大限度生长、繁殖及主动入侵的机制［1］。伴随寄主病原互作过程的发生，寄主和病原菌相应的生理、生化、细胞及分子生物学过程随之发生［2，3］。研究病原寄主两者亲和性互作的细胞学特征，从细胞角度阐明两者互作机制，为进一步研究病菌致病的分子机理、信号识别等具有重要的理论意义。

苜蓿（Medicago sativa）作为一种优质饲草，是我国栽培面积最大的牧草之一［4］。因其特殊的固氮能力、较强的适应性，国内外学者从形态、细胞和分子生物学等方面进行了系统而深入的研究［5－8］。苜蓿褐斑病（普通叶斑病）是由苜蓿假盘菌（Pseudopeziza medicaginis）引致的叶部病害，广泛分布于世界各主要苜蓿产区，是苜蓿生产中危害严重的叶部病害之一［9，10］。不仅造成牧草产量的损失，而且降低干草产品的品质。病菌侵染叶片形成平均直径约2mm的褐色圆形略突起的点状病斑，导致苜蓿叶片香豆雌酚等植物雌激素样物质大量增加，常使得家禽采食后引起流产、不育等疾病［11，12］。有关该病害的研究，最近的研究涉及细胞和分子生物学领域，不仅阐明了苜蓿褐斑病菌的侵染过程［13，14］，而且获得了一个与抗褐斑病基因相关的标记—M3E3－R169［15］。标志着苜蓿褐斑病的研究进入分子领域［16－18］。这些研究结果为苜蓿的抗病育种奠定了坚实的基础。在苜蓿—苜蓿假盘菌互作系统中，作者应用细胞学方法研究了苜蓿假盘菌侵染苜蓿叶片的侵染过程［13］，但两者亲和性互作的超微结构特征未见系统报道。本研究从病菌侵染以及感病寄主组织的细胞学反应2个方面阐述两者亲和性互作的关系，为进一步阐明病菌侵入的分子机制提供新思路。

1 材料与方法

1.1 供试菌种、苜蓿品种及其培养、繁殖

苜蓿假盘菌由宁夏大学草业科学研究所提供。挑取平板上培养的苜蓿假盘菌菌落，制成菌落悬浮液，移入20%V8汁CaCO3培养基上扩繁。

供试感病苜蓿品种为德国大叶（M.sativa）由宁夏大学草业科学研究所提供，按常规方法种植于直径为30 cm的花盆内，待二茬苜蓿生长至3周左右，避开嫰叶和老叶，选取生长一致的功能叶片，用灭菌水冲洗2遍后，置于底部铺有保湿滤纸的培养皿内待用。

1.2 接种

每皿放入10个苜蓿叶片，采用逆向产孢培养法进行接种。将V8培养基上成熟的苜蓿假盘菌菌落挑出，移至底部铺有湿润滤纸的培养皿盖上，于20℃黑暗条件下保湿4～6h，取出置于离体苜蓿叶片的正上方，利用子囊自然弹射进行接种，接种2～4h后将接种菌落移出。重复3次。为了保证离体叶片上有足够的游离水，不定期的用灭菌水对接种后的离体叶片进行喷雾。

1.3 透射电镜（TEM）样品的制备与观察

分别于接种后24h、48h、5d（症状初显）、10d（中显）和15d（病斑突破寄主表皮产生子囊盘）取样，并将样品切成0.3～0.5cm2的小块，按康振生［19］的方法制备样品。叶样经抽真空后于4%戊二醛（磷酸缓冲液，pH 6.8，0.25mol／L）中前固定16h（4℃），缓冲液反复冲洗，于1%饿酸（磷酸缓冲液，pH 6.8，0.25mol／L）中后固定2h。系列丙酮脱水，Epon812环氧树脂包埋，在40和60℃下分别聚合24和48h。样块进行修整后，超薄切片经醋酸双氧铀—柠檬酸铅双重染色，于JEM－1230型透射电镜下观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 病菌侵入寄主的超微结构特征

电镜观察发现，苜蓿假盘菌侵入寄主组织后，病菌菌丝在结构和功能上发生了一系列的变化。接种24～36 h，菌丝直接进入寄主细胞，以胞内方式生长，并向相邻的细胞扩展（图1－1，2）。进入寄主胞内的病菌菌丝有着较厚的外壁，且周围沉积电子致密度高的物质形成似菌丝鞘状结构将菌丝包裹，菌丝中可见占据面积较大的液泡，多个菌丝的菌丝鞘可相互连接，且随菌丝的扩展而延伸（图1－4，5），菌丝分隔处明显观察到菌丝细胞液在流动（图1－2）。扩展的胞间菌丝细胞壁比胞内菌丝明显加厚（图1－3）。菌丝在穿透临近细胞时，菌丝外壁的某一个部位与寄主细胞壁紧密接触，接触点颜色加深，液泡移向接触点似乎形成了较大的压力帮助其穿过胞壁组织（图2－7）。同时还观察到，侵入寄主细胞内的菌丝并不立即穿透寄主质膜，而是利用质膜将其包围，质膜突起部分沉积电子致密度高的物质，该区域随菌丝的扩展而延伸（图2－9，10，12）。胞内菌丝侵染叶绿体等细胞器时，菌丝鞘首先与叶绿体等细胞器膜相连（图2－8，11），然后破坏和瓦解基粒片层结构，被瓦解的细胞器结构沿菌丝和胞壁周围沉积（图3－14，15）。随着菌丝的扩展，菌丝鞘和包裹菌丝的质膜区域被降解（图3－17），而不再具有完整性。

2.2 寄主细胞病理变化的超微结构特征

超微结构发现，伴随病菌成功侵入、定殖和扩展，寄主细胞出现了一系列的病理变化特征。首先病菌侵入寄主细胞并在细胞内扩展发育，寄主原生质膜向内凹陷并形成突起，将侵入到寄主细胞内的菌丝包裹，菌丝与质膜始终是隔离的，寄主原生质膜和细胞壁之间沉积电子致密度深的物质，形成一个将病菌菌丝和寄主原生质膜隔开的界面层（图1－2，图2－10，11），这一现象表明寄主细胞膜的完整性遭到了攻击，但病菌并未对寄主细胞质膜产生直接的破坏作用，从而使病原菌不断地在原生质膜区域扩展。其次是菌丝体在寄主细胞内的不断扩大，周围的原生质膜也相应扩大其面积，始终将寄主原生质与菌丝体隔开。由于苜蓿褐斑病菌大部分的菌丝都是在寄主细胞内活动，因此，病菌和寄主细胞发生的一系列的营养、生物学及信号识别等都有可能发生在这一区域。当病菌菌丝扩展至质膜部位时，与其相邻细胞细胞壁内侧的质膜沉积电子致密度高的物质（图3－13）。进一步观察发现，沿交界面的外层排列了多个不等的液泡状物，有些是直接嵌入在界面层的组织内（图3－16）。随着侵染时间的延长，寄主细胞内叶绿体是最先被降解的细胞器，随后才是质膜的降解，多个细胞器被降解，降解物沉积在细胞壁和菌丝壁边缘（图3－19），在降解严重的寄主细胞内，形成一些结晶状的颗粒物（图3－20），随着病菌菌丝的不断扩展，大量胞内菌丝向胞外扩展，寄主完整的细胞结构消失，被病菌菌丝充满（图3－21）。

3 结论与讨论

本研究利用电子显微技术，研究了苜蓿假盘菌与苜蓿亲和性互作过程的超微结构特征，首次从细胞角度揭示了两者互作细胞学机制。为从分子生物学角度对其进行更深入的研究奠定了基础。

图1 侵入寄主细胞中的病菌菌丝的超微结构特征Fig.1 The ultrastructure of hyphal to invade the host cells

图2 病菌菌丝在寄主细胞中的扩展以及对寄主质膜影响的超微结构特征Fig.2 Mycelial expansion in host cells and the effects ultrastructure of host plasma membrane

图3 病菌侵染过程中寄主细胞表现出超微结构特征Fig.3 Ultrastructural features show during pathogen infect of host cells

在褐斑病菌侵入寄主细胞以及进一步的发育过程中，病菌菌丝穿透寄主细胞壁进入到寄主细胞内，在其发育和扩展的过程中，被内陷的寄主原生质膜所包围，于是病菌菌丝与寄主质膜之间形成了一个较大的交界面，这一界面将病菌菌丝与原生质隔开，但这一界面，并不是自始至终都是存在的。在侵染早期，这一界面将菌丝包围，并随病菌菌丝的扩展而相应的也在扩大其面积，且多个菌丝的界面可以相互连接，且菌丝在扩展和侵染叶绿体等细胞器时，菌丝鞘首先与质膜和细胞器膜相连形成界面层。初步分析，病菌获取营养物质、与寄主的相互识别、信息物质的交流等都有可能发生在这一界面。随着侵染强度的增加，这一界面被降解。笔者认为，这一现象可以说明，病菌为了达到侵入且在胞内定殖的目的，避免寄主细胞抵御病原侵染产生的防御反应，或快速的细胞死亡，利用寄主原生质膜形成交界面，将菌丝与寄主原生质隔开，这一层界面基质可能是苜蓿褐斑病菌侵入寄主细胞存在的一个活体营养阶段。由于白粉菌和霜霉菌等活体营养型真菌形成吸器进入寄主细胞，在吸器外膜和寄主细胞膜的界面之间形成界面基质将其分开，因此，界面基质的形成是大多数活体营养型真菌与寄主形成的一种共有现象［20］。而在炭疽菌的研究中，由于炭疽菌与寄主互作界面存在界面基质的现象，且与活体营养型真菌的界面基质相似，因此，菜豆炭疽菌（Colletotrichumlindemuthianum）被认为是具有活体和死体2个营养型阶段的植物病原菌［21］。苜蓿假盘菌在侵入寄主后也具有和寄主原生质膜形成界面基质的阶段，笔者根据电镜观察结果：苜蓿假盘菌在其侵染过程中，由于出现了一个类似与活体营养型真菌的界面基质阶段，这一阶段与菜豆炭疽病菌形成的界面基质也较类似，因此，初步认为苜蓿假盘菌的营养类型为半活体营养型真菌。

定殖在寄主细胞内的病菌菌丝，首先破坏的细胞器是叶绿体，这与robárová［14］报道的结果一致。随后是膜的降解，伴随质膜的降解，寄主细胞逐渐被瓦解。这一结果从细胞学角度解释了为什么感染褐斑病的苜蓿叶片光合速率下降的原因之一。南志标等［22］研究了苜蓿褐斑病对牧草质量和光合速率影响，褐斑病使苜蓿病叶中粗蛋白含量显著降低，与健叶相比，其含量减少25%，叶片光合速率随病害严重度的增加而降低。

病菌早期形成界面层，说明界面层中的电子致密度物质可能与病菌的致病性有关。其次，随病菌侵染强度增加，界面层外侧排列了多个液泡状物，并可见有的液泡状物与界面层嵌合。初步分析它们可能与界面层的降解有关。这些沉积物及液泡状物是受病菌诱导的还是寄主细胞早期的反应，有待于深入研究。

致谢：本论文中的研究内容在西北农林科技大学陕西省农业分子生物学重点实验室完成，在此谨表谢意。

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