农杆菌介导Chi－linker－Glu融合基因和bar基因转化玉米茎尖的研究

方永丰，李永生，彭云玲，王芳，王威，穆延召，王汉宁＊

（1.甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州730070；2.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州730070；3.甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州730070）

玉米（Zea mays）在粮食生产、饲料及工业原料等方面发挥着重要作用，目前已成为世界上第一大粮食作物［1］。真菌性病害（如大小斑病、茎腐病、穗粒腐病等）及田间杂草严重危害玉米的生长发育，导致玉米产量及品质的下降，常规育种培育抗病玉米自交系周期长、效率低，很难满足生产需要。20世纪70年代兴起的植物基因工程技术打破了物种之间基因交流的界限，可以将有利的外源基因导入受体植物中，为作物遗传改良带来了新的途径。但是，单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，玉米遗传转化技术一直发展缓慢。1987年Grimsley等［2］首先用农杆菌将玉米条纹病毒（maize streak virus）的cDNA导入玉米幼苗分生组织或靠近生长点的部位，98%的玉米叶片表现出病毒感染性状，表明T－DNA已经转化进玉米细胞，这一研究成果极大地推动了农杆菌介导的玉米遗传转化研究。1996年Ishida等［3］用超双元载体转化A188的幼胚，转化率高达5%～30%，外源基因能够稳定表达，并且70%的转基因植株可育，该实验有力地证明了农杆菌对单子叶植株与双子叶植物具有相同的转化机制，这是玉米遗传转化研究中里程碑式的工作。玉米遗传转化技术正日趋成熟，世界上有大批玉米转基因新品系得到推广种植，取得了显著的经济及社会效益［4］。

目前常用的玉米遗传转化方法有基因枪法［5］、农杆菌介导法［3］，花粉管通道法［6，7］等，农杆菌介导法由于成本低、操作方便而备受青睐。受体材料通常是幼胚或成熟胚的胚性愈伤组织，由于受基因型限制较大，生产上常用的优良玉米自交系诱导愈伤困难，转基因技术难以大规模推广应用，因此选择取材方便且转化不受基因型限制的转化系统成为玉米转基因研究的新方向。幼嫩茎尖的分生组织具有很强的分生能力，是玉米遗传转化的良好受体，Sidorov等［8］用农杆菌侵染由幼苗茎段诱导的愈伤组织，转化率在2%～10%，这一研究突破了受体取材的季节限制，但茎段愈伤组织诱导明显受基因型限制；Wang等［9］用农杆菌侵染损伤的玉米茎尖分生组织，虽然最终转化率为0.6%，却具有不受季节及基因型限制、操作简单、转化周期短等优点，目前该方法已同时在棉花（Gossypiumspp.）［10］、小麦（Triticum aestivum）［11］、玉米［12－14］中得到应用。

几丁质（聚乙酰胺基葡聚糖，chitin）和β－1，3－葡聚糖（β－1，3－glucan）是绝大多数真菌细胞壁的主要成分，而几丁质酶（chitinase，Chi，EC3.2.1.14）和β－1，3－葡聚糖酶（β－1，3－glucanase，Glu，EC3.2.1.39）分别催化二者的水解反应。Mauch等［15］研究证实，β－1，3－葡聚糖酶和几丁质酶能够协同抑制真菌生长，他们分离并纯化了豌豆（Pisum sativum）豆荚中的β－1，3－葡聚糖酶和几丁质酶，经过体外抑菌试验证实用这2种酶共同处理18种真菌之后，其中15种真菌的生长受到抑制，国内学者的研究［16，17］也证实了这一点。Broglie等［18］首次从菜豆（Phaseolus vulgaris）中分离出几丁质酶基因，并将其置于花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子控制下转化烟草（Nicotiana tabacum）和油菜（Brassica campestris），转基因植株对猝倒病产生了一定的抗性；将几丁质酶基因和葡聚糖酶双价基因导入水稻（Oryza sativa）、棉花、烟草、小麦等作物，转基因植株分别对稻瘟病、黄萎病、炭疽病和赤霉病等真菌性病害表现出一定的抗性［19－24］。目前将几丁质酶基因和β－1，3－葡聚糖酶基因同时转入玉米尚未见报道，本研究采用pbi121－Chi－linker－Glu－bar植物表达载体［25，26］，通过转化骨干玉米自交系郑58，以期获得具有抗真菌、抗除草剂的玉米种质新材料，同时为多基因共同转化玉米提供相应的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

玉米自交系郑58（由甘肃富农高科技种业有限公司提供），质粒pbi121－chi－linker－glu－bar（图1）及附有该质粒的农杆菌工程菌LBA4404、EHA105及C58c1由本实验室保存。预混型DNA聚合酶（Premix Taq）、DL2000TMDNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司，PCR检测引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，Basta除草剂购自西安罗森伯科技有限公司，乙酰丁香酮（AS）购自Sigma－Aldrich公司，其他试剂为国产或进口分析纯。

图1 pbi121－ubi－chi－linker－glu－ubi－bar载体结构图Fig.1 Diagram of plant expression vector pbi121－ubi－chi－linker－glu－ubi－bar

1.2 转化用培养基

YEP培养基：牛肉膏10g／L、蛋白胨10g／L、氯化钠5g／L（固体培养基加琼脂15g／L），pH 值为7.0，121℃灭菌15min。萌发培养基：MS＋蔗糖20g／L＋琼脂5.7g／L，pH值为5.8～6.0，121℃灭菌15min。重悬培养基：MS＋蔗糖20g／L＋葡萄糖10g／L＋水解酪蛋白0.2g／L，pH 值为5.1～5.5，121℃灭菌15min。

1.3 农杆菌工程菌的制备

将附有载体的农杆菌在含有利福平（50mg／L）和卡那霉素（50mg／L）的YEP固体培养基上划线培养1～2 d，从平板上挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的YEP液体培养基中28℃振荡培养，培养至对数期（OD600约为0.5）后在4 000r／min转速、室温下离心5min收集菌体，用重悬培养基稀释至不同浓度，侵染前加入乙酰丁香酮（AS）。

1.4 除草剂筛选浓度的确定

将Basta除草剂配成50，100，200，500，1 000mg／L五种不同质量浓度的水溶液，以蒸馏水作为空白对照，喷洒培养10d后长势一致的郑58非转基因植株，每个处理60株，以叶片挂液珠为准，分别于第3，7，15天观察叶片变化，统计植株存活率，以确定转化植株的最佳筛选浓度。

1.5 转化条件的选择

农杆菌菌液浓度选择：用OD600为0.2，0.4，0.6，0.8及1.0的农杆菌重悬液侵染10min，统计转化率；农杆菌侵染时间的选择：用OD600为0.6的农杆菌对小苗茎尖分别侵染8～16min，统计转化率；菌株的选择：选用3个不同的菌株LBA4404、EHA105及C58c1的农杆菌工程菌，菌液浓度OD600值为0.6，侵染10min，统计转化率；乙酰丁香酮（AS）浓度的选择：将重悬菌液中AS浓度分别调整为50，100，150及200μmol／L，菌株选择LBA4404，用OD600为0.6的农杆菌正常大气压下侵染10min，统计转化率；当农杆菌LAB4404菌液浓度OD600值为0.6，AS浓度为100μmol／L时，分别在正常大气压（101kPa）和50kPa负压下侵染10min，统计转化率；以上各因素均以除草剂抗性植株百分数作为评定标准，转化率（%）＝除草剂抗性植株数／移栽后成活植株数×100%，数据统计及多重比较采用Excel 2010及SPSS 13.0完成。

1.6 农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化

挑选整齐饱满的自交系种子，在超净工作台上进行消毒，依次为70%乙醇8min、升汞6min、无菌水洗涤3次，然后用加1.5倍种子体积无菌水室温下浸泡4～6h后，再用升汞消毒10min、无菌水洗涤5次，放入底部垫有无菌滤纸并用无菌水浸湿的培养皿中，28℃黑暗条件培养3～4d直到种子出芽。将发芽的种子转接至萌发培养基上，28℃黑暗条件下继续培养至芽长为4～6cm时在超净工作台上剥离胚芽鞘和幼叶，露出茎尖生长点，用手术刀轻微损伤茎尖用于转化；将茎尖浸泡在农杆菌重悬液中并置于真空干燥器中在50kPa的负压下侵染；结束后用滤纸吸干种子上多余的菌液，接种在萌发培养基上23℃黑暗条件下培养3d，直至重新长出新叶。

共培养结束后，将长出新叶的转化苗用温水洗掉培养基和菌体，移栽到花盆后放入人工气候室中，光照强度为500μmol／（m2·s），白昼温度为27／22℃，光周期为12h／12h，湿度为65%。大约2周后用Basta除草剂喷洒叶片进行筛选，10～15d后将存活的植株移栽至温室中。

1.7 转基因玉米植株的分子检测

用CTAB法［27］小量提取抗性植株叶片DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，紫外分光光度计检测浓度及纯度并稀释至200ng／μL。以抗性植株叶片DNA为模板，用融合基因特异检测引物CLG－F：GGGAGGCTTCTGCTGACAAG；CLG－R：TTTCCCAAACCAGCTTCACC（退火温度55.7℃，产物大小607bp）及bar基因特异性检测引物bar－F：GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC；bar－R：GCACCATCGTCAACCACTACAT（退火温度61.3℃，产物大小440bp），载体质粒DNA为阳性对照、非转化植株基因组DNA为阴性对照进行降落PCR检测［28］。PCR反应体系：Premix Taq 12.5μL，上游引物（10μmol／L）1.0μL，下游引物（10μmol／L）1.0 μL，模板DNA 1.0μL，ddH2O补足25μL。检测融合基因Chi－Linker－Glu的PCR反应程序为：95℃预变性5 min；94℃变性35s，55.7℃退火40s，72℃延伸1min，10个循环；94℃变性35s，50.7℃退火40s，72℃延伸1 min，25个循环；最后72℃延伸10min，4℃结束程序并保存。检测bar基因的PCR反应程序为：95℃预变性5 min；94℃变性30s，61.3℃退火30s，72℃延伸35s，10个循环；94℃变性30s，56.3℃退火30s，72℃延伸35s，25个循环；最后72℃延伸10min，4℃结束程序保存。

2 结果与分析

2.1 除草剂最佳筛选浓度的确定

Basta为非选择性广谱除草剂，主要成分是草丁膦（phosphinothricin），其中L－草丁膦能够强烈抑制谷胱甘肽合成酶（glutamine synthetase，GS，EC6.3.1.2）的活性，从而导致植物体内由于氨基酸降解等过程产生的氨的毒性无法解除最终使植株死亡。喷施除草剂3d后，植株停止生长，叶尖开始变黄；7d后，喷施高浓度除草剂的植株有一半死亡，低浓度有部分死亡；15d后，喷施1 000，500及300mg／L Basta的植株全部死亡，喷施200，100及50mg／L Basta的植株存活率分别为4.5%，56.2%及86.8%（表1），而对照植株生长正常，因此选用200mg／L Basta作为郑58转基因植株的最佳筛选浓度。

表1 不同浓度Basta对郑58幼苗存活的影响Table 1 Effects of Basta with different concentration on the survival rate of Zheng58seedlings

2.2 菌液浓度和侵染时间对转化效率的影响

菌液浓度和侵染时间是影响农杆菌介导下植物遗传转化的主要因素，菌液浓度过低或过高，都会使转化效率下降。采用不同浓度的农杆菌重悬液对茎尖进行侵染后，转化效率呈先上升后下降的趋势（图2），其中以OD600值为0.6时侵染效果最佳，平均转化效率达到4.5%，与其他浓度相比存在极显著差异（P＜0.01）。在最佳的菌液浓度下，选择适当的侵染时间可以有效提高转化效率，本试验设置6～14min共5个侵染时间，结果发现侵染6～14min其转化率的差异达到显著水平（P＜0.05）（图3），相比而言，侵染12min后其转化效果最好。

图2 菌液浓度对转化效率的影响Fig.2 Effects of bacterial concentration on transformation efficiency

图3 侵染时间对转化效率的影响Fig.3 Effects of infection duration on transformation efficiency

图4 不同菌株对转化效率的影响Fig.4 Effects of different strains on transformation efficiency

图5 AS浓度对转化效率的影响Fig.5 Effects of AS concentration on transformation efficiency

2.3 不同菌株对转化效率的影响

根癌农杆菌可分为3大菌系，分别为胭脂碱型、章鱼碱型以及琥珀碱型，不同菌系的菌株对植物的侵染能力有所不同。用3个不同菌系的农杆菌侵染玉米茎尖，转化效率之间的差异达到了极显著水平（P＜0.01），其侵染能力从大到小依次为LBA4404（章鱼碱型）＞EHA105（琥珀碱型）＞C58c1（胭脂碱型），选用LBA4404和EHA105均可达到一定的转化率，而选用C58c1的转化效率较低（图4）。

图6 渗透压力对转化效率的影响Fig.6 Effects of osmotic pressure on transformation efficiency

2.4 乙酰丁香酮浓度及真空渗透对转化效率的影响

农杆菌Vir区基因的活化及表达受到酚类物质的诱导，而乙酰丁香酮是主要的创伤信号或创伤诱导因子，单子叶植物遗传转化困难的主要原因之一是由于细胞中不能积累足够的酚类物质造成的［29］。将侵染液中乙酰丁香酮的浓度调整为150μmol／L时转化效率较高（图5），与其他浓度相比差异极显著（P＜0.01）。在侵染的同时施以50kPa的负压进行真空渗透能显著提高转化效率（P＜0.01）（图6）。

结果显示，本试验中农杆菌介导玉米茎尖遗传转化的最佳体系为LBA4404菌液浓度OD600值为0.6、乙酰丁香酮浓度为150μmol／L、50kPa负压下侵染12min。

图7 农杆菌介导玉米茎尖遗传转化Fig.7 Agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation of maize shoot apical meristem.

图8 抗性植株中融合基因Chi－Linker－Glu的PCR检测Fig.8 PCR detection of fused gene Chi－Linker－Glu in resistant plants

图9 抗性植株中bar基因的PCR检测Fig.9 PCR detection of bar in resistant plants

2.5 遗传转化及T0代转基因植株的分子检测

玉米茎尖遗传转化各阶段如图7所示。CTAB法提取32株抗性植株叶片基因组DNA，以质粒DNA扩增产物为阳性对照，以未转植株DNA扩增产物为阴性对照，进行降落PCR检测（图8，9）。结果显示，有13株抗性植株分别在607和440bp附近扩增出特异条带，而未转化植株没有相应条带出现，抗性植株的PCR阳性率为40%，采用茎尖遗传转化法转化率为2.6%，初步证明外源目的基因已整合进玉米基因组中。

3 讨论

除草剂临界浓度的确定对于转化体筛选至关重要。蒋晓芳［30］、王琨等［31］用昌7－2和郑58进行除草剂临界浓度筛选，确定的最佳浓度为200mg／L，本试验中确定的最佳筛选浓度也为200mg／L，其致死率为95.5%。对转化植物的PCR检测结果表明，使用该浓度进行筛选后抗性植株阳性率为40%，表明该临界浓度会产生较多的假阳性植株，但可以避免由于除草剂浓度过高而杀死部分阳性植株造成转化率降低。在遗传转化试验中，应根据具体的受体材料基因型确定最适筛选浓度。

农杆菌菌液浓度是影响转化效率的主要因素，菌液浓度过高，外植体上附着过多的农杆菌，会严重影响转化植株的后期生长；菌液浓度过低，外植体上农杆菌附着不足，转化效率低下［32，33］。本研究中菌液浓度以OD600值为0.6时转化效率最高，这与孙传波等［13］的研究结果一致。因为此时的农杆菌接近对数生长期，侵染活力较强，同时在该浓度下进行侵染对茎尖的伤害也较小，随着菌液浓度增大，转化植株在后期会出现心叶枯死，造成转化效率下降，这可能是由于农杆菌菌体密度较大，部分植株由于菌体附着过多导致过早死亡。巩健和杨芳［12］的研究结果表明玉米茎尖遗传转化侵染时间为5～10min均可，本研究选用6～14min共5个侵染时间进行侵染后发现，适当延长侵染时间可以有效提高转化效率，随着侵染时间的增长，转化效率有所提高，但以侵染12min后最佳。有研究表明［34］，单子叶植物遗传转化以附有超双元载体的农杆菌菌株LBA4404进行侵染效果最好，本试验中采用不同农杆菌菌株进行侵染，经过除草剂筛选后也发现LBA4404转化效率最高，C58c1最低。

目前报道的玉米遗传转化所用的外植体材料主要是幼胚和成熟胚及其愈伤组织，用于愈伤组织诱导的玉米材料仅限于A188、HⅡ及其衍生品种，其中以HⅡ的幼胚愈伤组织的转化效率最高［35］。尽管如此，由于幼胚的取材受到季节限制而且玉米幼胚的离体培养基因型依赖性强，使得玉米遗传转化技术的应用受到了限制。

以茎尖分生组织作为受体材料，由于茎尖分生组织在经过农杆菌侵染后很容易再生出植株，避免了组织培养过程，同时克服了由于基因型障碍造成转化植株再生困难的缺点，该方法可以作为改良国内骨干玉米自交系中个别不良性状的首选方法。采用茎尖遗传转化系统得到的T0代植株往往为嵌合体，因而不能在T0代进行过多鉴定，PCR检测只能初步证明外源基因是否整合进植物基因组中，其整合特性还需采用分子杂交等方法对后代植株进行进一步鉴定分析。

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