硼酸对L-阿拉伯糖异构酶催化合成D-塔格糖的影响

李晓卉，缪 铭，沐万孟，江 波，张 涛

（江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122）

硼酸对L-阿拉伯糖异构酶催化合成D-塔格糖的影响

李晓卉，缪 铭，沐万孟，江 波*，张 涛

（江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122）

基于硼酸与构型不同的单糖的络合能力不同，探讨了添加硼酸对L-阿拉伯糖异构酶催化D-半乳糖异构化为D-塔格糖的酶反应体系的影响，研究了pH、温度、硼酸加入量、加酶量等条件对硼酸作用的影响。结果表明：当反应条件为pH9.0，温度65℃，硼酸与底物的摩尔比1∶2，加酶量为0.39U/mL时，90g/L的底物D-半乳糖的转化率为50%，而不加硼酸时转化率为27%，表明硼酸对反应有很好的促进作用。

硼酸，半乳糖，塔格糖，络合

L-阿拉伯糖异构酶（EC 5.3.1.4，L-arabinose isomerase，简称 L-AI）是一种胞内酶，可以催化L-阿拉伯糖与L-核酮糖之间的异构化，也可以催化D-半乳糖异构化为D-塔格糖。早期关于L-AI的研究都是与生物机体内阿拉伯糖代谢相关，但目前该酶主要用于生物法工业化生产D-塔格糖。D-塔格糖是自然界中的一种稀有糖，是果糖在四位上的差向异构体。作为一种具有特殊保健功能的功能性甜味剂[1]，其甜度是蔗糖的92%，并具有低能量、降血糖、抗龋齿、改善肠道菌群等生理功能[2]。2001年塔格糖被美国食品与药物管理局（FDA）确定为普遍公认安全食品（GRAS）[3]。塔格糖的生产主要有化学合成和生物转化方法，目前生物转化法用的最有效的酶为L-阿拉伯糖异构酶。目前已发现的可以利用L-AI生产D-塔格糖的菌株主要有[4-9]Esche-richia coli、Geobacillus stearothermophilus（嗜热脂肪地芽孢杆菌）、Thermoanaerobacter mathrani（i嗜热杆菌）、Thermotoga maritima（海栖热袍菌）、乳酸菌、Bacillus stearo ThermophilusUS100（嗜热脂肪芽孢杆菌）等。硼酸是一种弱酸，四硼酸钠（又称硼砂）比硼酸稳定，在稀溶液中，1分子的硼砂可以水解成4分子的硼酸，硼酸根离子在水溶液中以[B（OH）3]或者[B（OH）4]-1形式存在。在1925年，Hermans就发现含顺式邻二羟基的化合物与硼酸反应可以得到两种不同的化合物，即1∶1络合物和1∶2络合物[10]。水溶液中单糖一般以呋喃糖（五元环）或吡喃糖（六元环）的形式存在，构型不同的单糖与络合剂的结合力不同，从而形成稳定性不同的络合物，因此可以影响单糖之间的异构化过程，改变反应的平衡点。基于这种差异性络合，研究探讨了硼酸对L-阿拉伯糖异构酶转化生成D-塔格糖的影响，并研究了反应条件对单糖异构化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Escherichia coliBL21（DE3） 实验室自有保藏菌种；硼酸、四硼酸钠（硼砂）、D-半乳糖、三羟甲基氨基甲烷等 中国医药集团化学试剂有限公司，分析纯；LB培养基 胰蛋白胨1.0%、酵母提取物0.5%、NaCl1.0%，pH 7.0。

UV-2102紫外可见分光光度计 上海UNICO公司；高速冷冻离心机 美国Eppendorf公司；SHA-2A冷冻水浴恒温振荡器 江苏太仓实验设备厂；超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；Agilent 1200系列高效液相色谱 Agilent公司；Sugarpark1糖柱 Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 L-阿拉伯糖异构酶的制备 将含有可以表达L-阿拉伯糖异构酶基因的菌种E.coli BL21接种LB培养基中活化培养至合适菌体浓度后，加入一定量的诱导剂诱导产酶12h，将培养液离心收集菌体。用pH7.0的Tris-HCl缓冲液重悬菌体，冰浴条件下超声破碎，离心收集上清液，即为粗酶液，保藏于0～4℃备用。

1.2.2 L-阿拉伯糖异构酶的酶活及转化率的测定酶活的测定：反应体系为50mmol/L底物D-半乳糖，50mmol/L Tris-HCl（pH=7.0）缓冲液和适量酶液，75℃水浴振荡反应30min，沸水浴停止反应，离心除去酶蛋白，将上清液适当稀释后，用半胱氨酸-咔唑法[11]测产物塔格糖的浓度，并计算酶活。所有反应均以缓冲液代替酶液做空白对照，实验数据为三次平行实验所得。

利用高效液相法测定反应的转化率，HPLC的检测条件为：流动相：脱气超纯水；柱温：85℃；流速：0.4mL/min；进样量：10μL；检测器：示差折光检测器。

酶活定义：以每分钟催化D-半乳糖产生1μmol塔格糖的酶量为一个酶活单位U。

反应转化率（%）=产物D-塔格糖的浓度/反应初始D-半乳糖浓度×100

相对转化率（%）=转化率/最高转化率×100

1.2.3 硼酸的加入对半乳糖转化率的影响 配制一定浓度的不同pH的硼酸-硼砂缓冲液，按一定比例与D-半乳糖溶液混合，加入酶液后于混匀，置于一定温度下反应一段时间。不加硼酸的体系中的缓冲液用50mmol/L的Tris-HCl缓冲液代替。

1.2.3.1 pH对硼酸催化效果的影响 反应体系为2mL，其中100mmol/L底物半乳糖（18g/L）、50mmol/L pH6.0～9.5硼酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，75℃下振荡反应16h，沸水浴灭酶，离心后测上清液中的产物塔格糖浓度，以最高转化率为100%计算相对转化率。

1.2.3.2 硼酸与半乳糖的摩尔比对反应的影响 在底物浓度为90g/L反应体系中，加入不同摩尔量的pH 9.0硼酸缓冲液，使最终硼酸根离子与半乳糖的摩尔比分别为0∶1、1∶5、2∶5、1∶2、3∶5、4∶5、1∶1，75℃振荡反应16h。测定转化率，以最高转化率为100%计算相对转化率，并与50mmol/L Tris-HCl 7.0体系下反应的转化率比较。

1.2.3.3 温度对硼酸催化效果的影响 两种反应体系同上，分别在60、65、70、75℃下振荡反应16h，测定转化率，并以最高转化率为100%计算相对转化率。

1.2.3.4 不同加酶量对转化率的影响 反应体系体积为2mL，其中90g/L底物半乳糖，50mmol/L pH9.0硼酸缓冲液（或pH7.0 Tris-HCl缓冲液），加入的酶量分别为0.15、0.27、0.39、0.50、0.62U/mL，在65℃水浴恒温振荡条件下反应16h，测定转化率。

2 结果与讨论

2.1 不同反应条件对硼酸催化效果的影响

2.1.1 pH对硼酸催化效果的影响 由图1可见，当pH低于7.0时，在不含硼酸的Tris-HCl缓冲液中的转化率略高于硼酸缓冲液反应体系，Tris-HCl缓冲液中最适转化pH为7.0；当pH高于7.0时，硼酸体系下底物的转化率开始高于Tris-HCl，并在9.0处达到最大转化率，为Tris-HCl缓冲液中的两倍左右。随着体系碱性的增强，硼酸的络合作用逐渐增强，更多的产物塔格糖与硼酸络合，促使反应向生成塔格糖的方向转移。一般认为硼酸和单糖络合在碱性条件下较好，Bonnerjea等人[12]研究认为硼酸和单糖络合的最佳pH为8.2左右。无硼酸存在时，实验所用的L-阿拉伯糖异构酶的最适pH为7.0，碱性太强会影响酶蛋白分子的结构，进而影响其活性，减弱酶的催化作用。由图1可见，存在硼酸时，碱性条件对反应的促进作用大于对酶的催化作用的抑制作用，但当pH高于9.0后，转化率开始下降，最终确定硼酸体系中最适转化pH为9.0。

2.1.2 硼酸与半乳糖的摩尔比对反应转化率的影响如图2所示，与第一个点即硼酸浓度为0的反应体系相比，硼酸的加入使反应的转化率有了明显的提高，当硼酸根离子与半乳糖的摩尔比为1∶2时，转化率最高；当硼酸量再增加时，产物量逐渐下降，这可能是因为过高的硼酸量虽然可以络合更多的糖，使反应向生成塔格糖的方向进行，但同时也会降低酶本身对异构化的催化效果。

2.1.3 温度对硼酸催化效果的影响 如图3所示，在两种反应体系中，反应都在65℃时达到最高转化率。这可能是因为D-半乳糖到D-塔格糖的异构反应虽然在较高温度下会向生成D-塔格糖的方向转移，但是酶在较高的温度下稳定性较差，而且温度越高，硼酸对酶的影响也越大。

2.1.4 不同加酶量对转化率的影响 从图4可以看出，加酶量0.39U/mL为最适加酶量，再增加酶量，转化率没有明显的增加，说明酶与底物已经基本饱和，多余的酶分子无法与底物结合。在两种反应体系中该趋势相似，最适加酶量都为0.39U/mL，也说明适量的硼酸对酶的催化活性影响不大。反应16h后，没有添加硼酸的反应体系中D-半乳糖的转化率只有27%，有硼酸的体系转化率接近50%，说明硼酸的加入有效地提高了底物转化率。

3 结论

本文研究了将硼酸加入到L-阿拉伯糖异构酶反应体系中后，对D-半乳糖转化成D-塔格糖的影响，研究得到最佳的反应条件为pH9.0，温度65℃，硼酸离子与半乳糖的摩尔比1∶2，加酶量为0.39U/mL，当底物浓度为90g/L时，在该最适条件下反应16h后，D-半乳糖的转化率由27%提高到50%，说明硼酸对塔格糖的生成有很大的促进作用，有应用于工业化生产的潜力。

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Production of D-tagatose using L-arabinose ismoerase through addition of boric acid

LI Xiao-hui，MIAO Ming，MU Wan-meng，JIANG Bo*，ZHANG Tao
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Based on different affinities of boric acid to D-galactose and D-tagatose，an L-arabinose ismoerase mutant enzyme was used to catalyze the isomerization of D-galactose to D-tagatose with boric acid.The effect of pH，temperature，molar ratio of boric acid and the enzyme addition was studied.The results showed the optimum conditions for production of D-galactose were pH 9.0，65℃，1∶2 molar ratio of boric acid to D-galactose，the amounts of enzyme was 0.39U/mL.Under this condition，in 16h，the convertion was 50%when the concentration of D-galactose was 90g/L with boric acid，while 27%in the Tris-HCl buffer system without borate，which showed that boric acid had good impact on the production of D-tagatose.

boric acid；galactose；tagatose；complexing

TS201.2

A

1002-0306（2012）11-0315-03

2011－08－01 * 通讯联系人

李晓卉（1987-），女，硕士研究生，研究方向：食品酶技术。

江苏省社会发展科技支撑项目（BE2010626，BE2011622和BE2011766）。