TGF-β3基因与腭裂发生的相关研究进展

梁硕，史辛艺，王志斌，关方霞，2

(1.郑州大学生物工程系 河南 郑州 450001;2.河南省医学科学院 河南 郑州 450003)

唇腭裂是新生儿口腔颌面部最常见的一种先天性发育畸形，其发病率因地域、人种和民族而异，我国的发生率约为0.182%，居新生儿出生缺陷发生率的首位［1］。唇腭裂分为综合征型和非综合征型两种，综合征型唇腭裂是指以某综合征的表型之一出现的，通常多由单个基因突变引起;而非综合征型唇腭裂(nonsydromic cleft of lip with or without palate，NSCL/P)，是指单发的唇裂、腭裂或唇裂合并腭裂，是一种排除了其他系统畸形和综合征的唇腭裂，占唇腭裂的70%以上。NSCL/P的病因比较复杂，目前认为它是由遗传和环境因素相互作用所致的一种多基因多因素遗传病。现已发现与唇腭裂相关基因有很多，常见的有 BCL3，TGFA，TGF-β3 等，其中转化生长因子-3(transforming growth factor-β，TGF-β3)是腭突发育过程中的关键因子之一。因此本文就TGF-β3基因与腭裂发生的相关研究进展进行综述，以期为深入研究该病的病因提供参考依据。

1 TGF-β3在腭发育过程中的作用

TGF-β3基因位于14q24，大小为43 kb，含6个内含子和7个外显子，编码一系列TGF-β家族蛋白，参与调节胚胎发生和细胞分化，它是TGF-β家族中非常重要的一员。TGF-β家族在腭发育过程中调控细胞增殖、分化和凋亡，细胞移行，上皮间充质转化，细胞外基质的合成及沉积，基底膜的降解等。在哺乳动物中TGF-β 有3 种亚型:TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3。尽管3种亚型结构相似，含7l%～76%相同的基因序列，都通过Smads或MAPKs信号通路，并且在不同种族间具有高度保守性，但它们在腭突发育过程中的作用却是各不相同的。研究表明，TGF-β3基因缺陷小鼠往往都形成腭裂，提示TGF-β3在两侧腭突的融合过程中起主要作用;TGF-β2基因缺陷小鼠多有上颌骨和下颌骨畸形，其中腭裂的发生率为23%;TGF-β1基因缺陷小鼠在胚胎第11天之前死亡，无法研究其在上腭发育中的作用［2］。

1.1 腭的发育过程 胚胎早期原始鼻腔和口腔是彼此相通的，腭的发育使口腔与鼻腔分开。胚胎发育至第9周左右时，两侧的侧腭突与前腭突自外向内、向后方向生长，最后形成完整的大部分硬腭、软腭和悬雍垂，将口腔与鼻腔完全隔开。整个过程包括两侧腭突的生长、上抬、粘附及融合等。其中腭突中嵴上皮(medical edge epithelia，MEE)细胞在腭突融合过程中显得尤为重要:首先是其外层上皮细胞从腭突接触点开始发生程序性细胞死亡脱落，然后通过侧腭突内细胞的紧密接触形成腭中线，侧腭突发生向水平方向的转动并向中线生长。MEE细胞进一步通过细胞凋亡、分化及上皮间充质转化等途径降解。腭中线随着细胞的降解而消失，间充质细胞在中线处融合，形成完整的腭［3］。腭的发育过程受许多因素的影响，可能出现发育异常从而导致腭裂或颌裂。

1.2 TGF-β3在胎鼠腭发育过程中的表达 小鼠孕11～16 d相当于人类的孕6～12周，该时期是腭部发育的关键时期。孕11.0～11.5 d，上颌突长出腭突并垂直延伸，此时TGF-β3仅在上皮细胞中表达，并持续表达至上皮间充质转化结束、MEE细胞消失为止。孕12.0～12.5 d，腭突仍呈垂直生长，可分别在上皮及间充质细胞中检测到 TGF-β1和 TGF-β2的表达。孕13.0～13.5 d，腭突抬高，TGF-β3 在上皮细胞中表达升高，促进了腭中线的形成［4］。孕14.0～14.5 d，两侧腭突接触前MEE细胞中的TGF-β3表达水平开始迅速升高，口腔样上皮及鼻腔样上皮中也有TGF-β3表达。TGF-β1和TGF-β3在同种上皮细胞中均有表达，TGF-β2则在间充质细胞中持续表达，少量MEE细胞中也有 TGF-β2 表达［4］。腭中线形成后，TGF-β3 表达水平达最高峰，上皮间充质转化活跃。孕15.0～15.5 d，腭突开始联会融合，MEE细胞持续表达TGF-β1和TGF-β3，直至MEE细胞完全失去其上皮表型转化为间充质细胞［4］，但与孕 13.5～14.5 d 相比，尚未完成转化的上皮细胞TGF-β3的表达量明显减少［4］，腭中线两侧的间充质细胞TGF-β2持续高表达［5］。孕16.0～16.5 d，融合后的腭组织中只含少量表达TGF-β3的上皮细胞，TGF-β3主要在间充质细胞中表达;TGF-β2在中线两侧间充质细胞中广泛表达，而TGF-β1只在腭突和鼻突的骨化区表达。

2 TGF-β3在腭发育过程中的作用机制

目前，研究发现TGF-β3在腭发育过程中，对腭突生长和抬高的作用不大，主要作用于腭突的融合过程。Taya等［3］第一次提出 TGF-β3是通过诱导 MEE细胞表面丝足的形成来促进腭突融合的，并将其作用机制阐明如下:①丝足使MEE细胞的表面积增大，有利于腭突接触粘附;②丝足富集大量的细胞粘附分子和细胞桥粒为腭突接触粘附提供便利;③丝足能使MEE细胞表面电荷减少，对腭突接触和粘附十分重要;④丝足能使细胞转化能力增强，有利于MEE细胞转化为口腔样上皮或鼻腔样上皮及上皮间充质，促使腭中线降解。新近研究［6］发现，与正常小鼠相比，在腭突接触前，TGF-β3基因缺陷小鼠MEE细胞中的某些细胞外基质分子和细胞粘附分子表达异常。而在体外实验中添加外源性TGF-β3可恢复TGF-β基因缺陷小鼠MEE细胞中上述分子的表达量及分布，可促进腭突融合。

腭中线降解是腭突融合过程中十分关键的一环。目前关于腭中线降解机制的研究较多，但分歧较大，主要集中在细胞移行途径和细胞程序性死亡途径两点上。Murillo等［7］认为腭中线降解仅经过细胞移行途径，而Dudas等［8］认为腭中线降解仅经过细胞程序性死亡途径。尽管对腭中线降解途径的认识存在分歧，但他们一致认同不管是细胞移行还是细胞程序性死亡均为TGF-β3所诱导。而 Ahmed等［9］研究发现，细胞移行和细胞程序性死亡都参与了TGF-β3诱导的腭中线降解，其始发反应为细胞周期停滞，还发现上述3个反应是有序而独立的过程。Iordanskaia等［10］进一步研究发现，细胞周期停滞是上皮间充质转化和细胞凋亡的先决条件，处于G1/S期的细胞进入上皮间充质转化，处于G2/M期的细胞发生细胞凋亡。细胞周期停滞主要由TGF-β1基因诱导，上皮间充质转化和细胞凋亡主要由TGF-β3基因诱导，而上皮间充质转化和细胞凋亡的同时还受到多种信号分子的调控，如p38MAPK、TGF-β 受体、Smads、STAT3 及 PKA 等［11］。

3 TGF-β3基因的多态性与腭裂发生的相关性

TGF-β3基因与腭裂发生相关的认识基于对基因敲除小鼠的研究。Kaariene等［2］和 Taya等［3］研究发现，TGF-β3-/-小鼠表现为腭裂畸形，但无其他颅面畸形发生。Brunet等［12］应用TGF-β3抗体及反义寡核苷酸抑制 TGF-β3，可阻断正常小鼠腭板的融合。而Yang和Lee［13］研究发现，在鸡胚腭裂模型中添加外源性TGF-β3，可诱导其腭板融合。

关于TGF-β3基因多态性与人类NSCL/P关系的研究报道结果各不相同。国内朱江辉等［14］对170个NSCL/P核心家庭成员DNA标本进行TGF-β3 CA重复序列多态性检测。经传递不平衡检验和基于单体型的单体型相对危险度检验分析，未发现TGF-β3 CA重复序列多态性与NSCL/P发生之间有关系，但应用家系为基础的相关性检验分析发现TGF-β3基因突变与NSCL/P发病危险之间有关联。林健燕等［15］对200例NSCL/P患者各基因位点多态性检测，发现 TGF-β3 G15572多态性与母亲妊娠早期被动吸烟、感染史、补充维生素及父亲知晓妊娠前吸烟、饮酒对NSCL/P的发生具有交互作用。而刘宁等［16］对48例NSCL/P患者的TGF-β3基因SfaNI多态性进行检测，发现其与中国人群 NSCL/P发生无关。国外Suazo等［17］对智利150例NSCL/P患者及其父母的TGF-β3基因进行等位基因遗传不平衡检验，发现TGF-β3基因多态性与NSCL/P有关。但Marazita等［18］针对多国820个家庭6565例的标本进行了连锁分析，结果却未发现TGF-β3基因多态性与NSCL/P相关。有研究表明，先天性腭裂患者TGF-β3基因很少发生突变［19］，仅表现为表达水平的改变。Nogai［20］、Gan［21］、柴茂洲等［22］在动物实验中也得出了相同的结论。提示TGF-β3基因表达异常与腭裂发生具有相关性，其机制可能与该基因DNA甲基化等表观遗传现象有关。

4 总结与展望

在动物实验中，TGF-β3基因在胚胎腭发育的关键时期表达，并参与腭突融合的调控，因此，TGF-β3基因突变与腭裂的发生具有明确的因果关系。但在临床研究中，TGF-β3基因的多态性与腭裂相关性的研究结果却不相同，这可能与地域、种族及研究方法的差异有关。而TGF-β3基因在胚胎时期腭发育过程中的作用机制尚未阐明，腭裂发生是否与环境-基因相互作用有关也需进一步研究。

［1］Forrester M B，Merz R D.Descriptive epidemiology of oral clefts in a multiethnic population，Hawaii，1986-2000［J］.Cleft Palate Craniofac J，2004，41(6):622-628.

［2］Kaartinen V，Voncken J W，Shuler C，et al.Abnormal lung development and cleft palate in mice lacking TGF-β3 indicates defects of epithelial-mesenchymal interaction［J］.1995，11(4):415-421.

［3］Taya Y，O'Kane S，Ferguson M W.Pathogenesis of cleft palate in TGF-beta3 knockout mice ［J］.Development，1999，126(17):3869-3879.

［4］Rotzer D，Roth M，Lutz M，et al.Type Ⅲ TGF-beta receptor-independent signaling of TGFbeta2 via TbetaRTI-B，an alternatively spliced TGF-betape Ⅱ receptor［J］.EMBO J，2001，20(3):480-490.

［5］Martinez-Alvarez C，Blanco M J，Perez R，et al.Snail family members and cell survival in physiological and pathological cleft palates［J］.Dev Biol，2004，265(1):207-218.

［6］Martinez-Sanz E，Del Rio A，Barrio C，et al.Alteration of medial-edge epithelium cell adhesion in two Tgf-beta3 null mouse strains［J］.Differentiation，2008，76(4):417-430.

［7］Murillo J，Maldonado E，Barrio M C，et al.Interactions between TGF-beta 1 and TGF-beta3 and their role in medial edge epithelium cell death and palatal fusion in vitro［J］.Differentiation，2009，77(2):209-220.

［8］Dudas M，Li W Y，Kim J，et al.Palatal fusion-Where do the midline cells go?A review on cleft palate，a major human birth defect［J］.Acta Histochem，2007，109(1):1-14.

［9］Ahmed S，Liu C C，Nawshad A.Mechanisms of palatal epithelial seam disinter-gration by transforming growth factor(TGF)beta-3 ［J］.Dev Biol，2007，309(2):193-207.

［10］Iordanskaia T，Nawshad A.Mechanisms of transforming growth factor b induced cell cycle arrest in palate development［J］.J Cell Physiol，2011，226(5):1415-1424.

［11］Tian H Y，Zhang K H，Gao X，et al.Comparative proteomic analysis of cell cycle-dependent apoptosis induced by transforming growth factorbeta［J］.Biopys Acta，2009，1794(10):1387-1397.

［12］Brunet C L，Sharpe P M，Ferguson M W.Inhibition of TGF-beta3(but not TGF-beta 1 or TGF-beta 2)activity prevents normal mouse embryonic palate fusion［J］.Int J Cev Biol，1995，39(2):345-355

［13］Yang B E，Lee J H.Effects of TGF-β3 on epithelial-mesenchymal transformation and epidermal growth factor receptor expression in palatogenesis of chicken embryo ［J］.Koean Cleft Lip Palate Assoc，2001，4:13-26.

［14］朱江辉，任爱国，郝玲，等.转化生长因子β3基因多态性与唇腭裂关联的核心家庭分析［J］.中国生育健康杂志，2009，20(6):346-351.

［15］林健燕，栾荣生，郭泽强，等.BMP4，TGF-β3基因多态性与环境暴露在非综合征性唇腭裂发生中的交互作用［J］.中国口腔医学杂志，2010，45(10):596-600.

［16］刘宁，刘嘉茵，崔毓桂，等.TGF-β3基因SfaNI多态性与非综合性唇腭裂的遗传易感性［J］.中华美容整形外科杂志，2008，19(2):152-155.

［17］Suazo J，Santos J，Scapoli L，et al.Association between TGF-B3 and non-syndromic cleft lip with or without cleft palate in a Chilean population［J］.Cleft Palate Craniofac J，2010，47(5):513-517.

［18］Marazita M L，Lidral A C，Murray J C，et al.Genome scan，fine-mapping，and candidate gene analysis of non-syndromic cleft lip with or without cleft palate reveals phenotype-specific differences in linkage and association results［J］.Hun Hered，2009，68(3):151-170.

［19］田晓菲，金先庆，罗庆，等.CTGF、TGFβ3及其受体在唇腭裂裂缘组织中的表达及意义［J］.重庆医科大学学报，2009，34(1):55-58.

［20］Nogai H，Rosowski M，Grun J，et al.Follistatin antagonizes transforming growth factor-beta3-induced epithelial-mesenchymal transition in vitro:implications for murine palatal development supported by microarray analysis［J］.Differentiation，2008，76(4):404-416.

［21］Gan L Q，Fu Y X.Liu X，et al.Transforming growth factor-B3 expression up-regulates on cleft palates induced by 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in mice［J］.Toxicl and Ind Healyh，2009，25(7):473-478.

［22］柴茂洲，李承浩，何永红，等.四氯二苯对二嚼英和地塞米松诱导小鼠腭裂及转化生长因子-β3和受体活化样激酶5的表达［J］.华西口腔医学杂志，2010，28(4):356-360.