骨髓间充质干细胞与终末期肝病

胡祥 刘沐芸 杨晓菲

由于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率较高，感染者进而罹患急慢性肝炎、肝纤维化乃至肝硬化、肝癌的事件屡见不鲜，肝脏疾病目前已经成为中国医疗卫生的主要负担之一[1]。肝脏疾病进展到肝硬化等终末期肝病时，通常累及广泛肝实质细胞，肝组织再生能力下降，造成肝功能失代偿并最终导致肝功能衰竭[2]。常规的内科保肝治疗效果不佳，病死率很高。目前原位肝移植仍然是治疗终末期肝病最有效的措施，但供体缺乏、移植排斥反应及免疫抑制剂所引起的并发症等都严重限制了其应用[3]。近年来干细胞技术的发展为治疗终末期肝病带来了新的希望。干细胞疗法因其简单易行，创伤小而成为关注的焦点。

很多的研究证明骨髓可以用作肝干细胞移植的来源。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是骨髓内的一组干细胞，目前被认为具有广泛的治疗前景[4]。MSCs具有高度自我更新能力和多向分化潜能，其在特定条件下能够横向分化为肝细胞的研究为其移植治疗肝脏疾病提供了理论依据。本文将对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）在治疗肝病方面的研究进展进行综述。

一、MSCs作为肝脏干细胞的直接证据

在适当的条件下，源于中胚层的BM-MSCs可以跨越胚层向内胚层及外胚层的组织、细胞分化，比如分化为肝细胞、胆管上皮细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、神经元细胞和视网膜细胞等[5-6]。这一特性使得MSCs在临床治疗方面的应用获得了关注。

MSCs之所以具有好的治疗前景，是因为它们可以被种植并在特定的器官中可以长期存活。动物实验已经证实，MSCs移植术后，供体的细胞可以插入到受体动物体内不同的间质组织中[7-8]。另有研究显示，在小鼠肝损伤模型中输注MSCs，可以提高小鼠的短期生存率，可能是由于MSCs改变了小鼠免疫细胞的功能，可以降低细胞坏死率并促进肝脏细胞的再生[9]。

MSCs在活体内、外均能够分化为具有肝细胞功能的细胞。Lee等[10]将人骨髓和脐带血来源的MSCs用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)和Oncostatin M进行诱导，4周后，细胞呈现肝细胞典型形状。同时，这些细胞以时间依赖的方式表达肝细胞特异的标志基因，并能够分泌白蛋白和尿素，储备糖原，摄取低密度脂蛋白等。Sato等[11]用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)转染的大鼠BM-MSCs与新鲜分离的大鼠肝细胞体外共同培养，2周后即在绿色荧光蛋白阳性的BMMSCs检测到白蛋白及CK18。诸多体外实验已证实细胞生长环境(如生长因子及细胞外基质)在调节MSCs向肝细胞系特异性分化中起了至关重要的作用，甚至超过了HGF等生长因子的诱导作用。Qihao等[12]将MSCs与成体肝细胞进行共培养，诱导MSCs像肝样细胞进行分化。研究结果显示，共培养的细胞呈现肝细胞典型形态，并表现出正常的增生能力，在mRNA和蛋白水平大量表达白蛋白、甲胎蛋白和CK18。Arikura等[13]将先天性白蛋白缺乏症大鼠肝脏做70﹪切除后，立即通过门静脉植入正常大鼠BM-MSCs，4周后在受体肝脏检测到白蛋白阳性并表达白蛋白mRNA的肝细胞，血清中也检测到白蛋白。

Han等[14]研究显示，来源于HBV相关失代偿肝硬化患者外周血单个核细胞（Peripheral Blood Monouclear Cell，PBMC）也可以分化为肝细胞样的细胞，表达肝细胞的标志物，并在体外培养中显示出特定的肝脏生物学功能。而接受了自体PBMC细胞移植的患者，症状改善持续达一年多，患者体内的肝细胞样细胞被检测出表达肝脏特异的基因，并可以合成分泌白蛋白，尿素，转氨酶和糖原，与正常的人肝细胞株QZG十分相似。

二、MSCs治疗作用的可能机制

临床及动物实验研究均表明，MSCs能够促进肝损伤后的内源性肝细胞重建，并可减轻氧化应激反应，可能的机制包括细胞替代和旁分泌作用[15]。另一项新的研究显示，骨髓来源的MSCs可以在特定条件下分化成肝样细胞，并且诱导效率可达100﹪[16]。将这种来源的肝样细胞移植到免疫缺陷的肝衰竭小鼠模型中，可以使小鼠存活，并重塑高达5﹪的受体肝组织。尽管MSCs来源的肝样细胞能够在移植术后的受者体内被检测出，但对于暴发型肝衰竭（fulminant hepatic failureF，FHF）的快速治疗作用提示MSCs疗法除了直接分化成干细胞的细胞替代机制，尚存在其他机制。MSCs对氧化应激作用的抑制作用，能够使受体小鼠迅速恢复，刺激肝细胞的增生，均提示MSCs可能通过旁分泌作用进行调节[15]。

诸多研究者认为干细胞旁分泌作用所分泌的细胞因子对肝脏损伤的修复发挥重要的调节作用。研究显示MSCs能够分泌多种生物活性因子，如HGF、基质细胞衍生因子-1/CXC趋化受体4(SDF-1/CXCR4)等。HGF能够对肝损伤进行正向调节，促进移植的骨髓干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）向肝细胞分化，且通过与SDF-1的相互作用对干细胞的替代与补充起重要作用[17]。另外，HGF的分泌可以抑制损伤肝脏中残存的肝细胞的进一步凋亡[18]。Jung等[19]将同种异体的BMSCs移植到CCl4诱导的小鼠肝损伤模型中，观察发现移植术后模型鼠的肝脾肿大及肝坏死均得到不同程度改善，移植的干细胞能够特异地迁移到受损的肝组织。MSCs可以通过旁分泌作用调节肝纤维化过程中剩余肝脏星形细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的作用，抑制肝硬化的发展。Parekkadan等[18]研究了MSCs移植术后对肝纤维化的SCs的免疫调节作用。MSCs诱导白介素10( IL-10 )的分泌，所营造的细胞微环境促进HSCs细胞IL-6的分泌，促进HSCs的增殖及相关抗原的合成。这表明MSCs细胞对肝纤维化和肝脏的炎症反应具有治疗作用，对于终末期肝病的治疗用样具有意义。

另外，MSCs因其移植术后可以在特定器官存活较长时间。Allers等[8]将人MSCs移植入成体小鼠内，示踪技术在小鼠骨髓、脾脏及其他间充质组织观察到MSCs细胞的存在，随着随访时间的延长，4～13个月后，在骨、软骨和肌肉组织中观察到大量的人源细胞，表明MSCs向特定组织细胞的分化与迁移。

三、BM-MSCs移植治疗肝脏疾病

（一）临床前实验

BM-MSCs在活体内、外转化为肝细胞，为临床治疗遗传及获得性终末期肝病提供了潜在的临床应用价值。动物实验的研究结果证实了移植到肝脏的MSCs参与受损肝脏的功能修复。Sakaida等[20]将自体骨髓细胞移植到GFP/CCl4诱导的小鼠肝硬化模型，发现移植的细胞在损伤的肝组织内能有效地增殖分化为肝细胞，其能够分泌白蛋白，并改善肝脏功能，从而提高了患病小鼠的生存率。

细胞因子对肝损伤的修复有重要作用，已有很多研究显示细胞因子联合MSCs移植可促进移植细胞向干细胞进行分化。Ishikawa等[21]发现FGF能够促进移植的BMSCs分化为肝细胞，将FGF-2联合BMSCs移植到CCl4诱导的鼠肝损伤模型后，发现模型鼠的转氨酶水平升高，生存率也得以提高。Oyagi等[22]将鼠BMSCs在加有HGF的条件下培养2周，荧光标记后均移植到CCl4诱导的大鼠肝损伤模型内，发现加HGF培养的BMSCs恢复了模型鼠的血清白蛋白水平，并显著降低了转氨酶，抑制了肝纤维化。

如前所述，MSCs可以通过旁分泌作用激活损伤的肝脏中剩余HSCs的作用，抑制肝硬化的发展[18]。Zhao等的研究[23]报道，将MSCs移植入小鼠的肝纤维化模型中，可以观察到MSCs移植可以降低CCl4或DMN诱发对小鼠纤维化的发生率。另外，MSCs移植组小鼠肝脏的胶原沉着量和α-SMA染色较对照组低40﹪～50﹪，纤维化指标也有类似的结果。应用中药归元方联合自体BMSCs移植治疗大鼠肝纤维化模型，该联合疗法可以减小肝损伤区域，使肝功能及肝纤维化评分获得一定程度的改善。免疫组化结果显示移植的BMSCs能在肝损伤及肝纤维化所形成环境中可以存活并进行增殖，进而向肝细胞进行分化[24]。动物模型的报道进一步明确了BMSCs具有与胚胎干细胞相似的干细胞特性，即这些细胞能够在体外培养及扩增而保持其干细胞的多向分化潜能，为其成为干细胞移植疗法的种子细胞提供了临床前依据。

（二）临床研究

临床上研究MSCs对肝脏的修复作用至少应该包括两个方面，即对受损肝脏功能的恢复以及促进受损肝脏的再生。Mohamadnejad等[25]应用MSCs移植治疗失代偿肝纤维化的一期临床试验显示，MSCs移植术后，4例患者的症状均有不同程度改善，肝脏的体积也有所增加。自体MSCs取自患者髂后上棘，细胞经体外培养后，经外周静脉输注进患者体内。输注的细胞总体积为20 ml，平均细胞数目约为3.2 × 107。干细胞输注后，未发生与治疗相关的不良反应，CT检查亦未见局灶性的肝脏损伤。随访6个月和12个月的数据显示，相比治疗前，所有患者的外周水肿有显著改善。6个月时，肝功能相关的生化检查以及MELD评分的改善情况最明显，大多数患者的改善可以持续12个月。影像学检查显示，6个月时，3例患者的肝脏体积有所增加。SF-36问卷调查提示患者在干细胞治疗后生活质量（生理和心理方面）明显改善。该研究不仅显示MSCs可以改善终末期肝硬化患者的肝脏功能，同时，肝脏体积的增加提示，MSCs可能在抑制肝纤维化，促进肝脏再生方面有一定的作用。

Terai等[26]报道将9例肝硬化患者的自体BMSCs通过外周静脉输注到患者体内，移植24周后观察发现所有患者血清白蛋白、总蛋白及Child-Pugh评分均有显著提高。Kharazih等[27]报道了另一项Ⅰ-Ⅱ期临床试验，将自体MSCs经外周血或门静脉输注到8例肝硬化患者体内，输注的平均细胞数为(3～5)× 107。实验结果显示，所有患者均能很好的耐受干细胞输注，随访3个月，未发生严重不良反应，并可不同程度改善肝脏功能。肝脏功能指标，如MELD评分从治疗前的17.9 ± 5.6减低到治疗后的 10.7 ± 6.3（P< 0.05）；治疗后，凝血酶原复合物标准比从 1.9 ± 0.4 减至 1.4 ± 0.5(P< 0.05)；血清肌氨酸酐在治疗前为（114 ± 35）µmol/L，治疗后则降至（80 ± 18）µmol/L(P< 0.05）；血清白蛋白水平有所升高，而血清胆红素则有所下降。

上述研究均表明MSCs移植治疗肝纤维化是安全可行的，适宜的移植细胞种类和数目，可不同程度促进失代偿肝硬化患者的症状改善。Lorenzini等[28]通过对干细胞移植研究的综合评价，认为目前干细胞移植用于治疗肝病患者的临床研究结果令人鼓舞，但为了更好地救治患者，进一步的研究需要合理设计实验，并进行良好的随机对照，以保证干细胞疗法的安全有效。尽管上述研究规模不大，欠缺对输注入体内的干细胞的追踪，但所取得临床效果是非常显著的，进一步的研究需增大样本量，进行体内干细胞示踪，提高实验的整体严谨性，增加临床试验的验证效能，使得细胞疗法更加安全、有效和可控，并可以早日用于临床治疗。

四、小结与展望

干细胞不仅可以成为肝衰竭患者度过危险期、等待肝源进行肝移植的一个过渡方法，又能直接修复损伤肝脏，改善肝脏功能，作为细胞疗法应用于临床治疗肝衰竭、各种终末期肝病具有非常好的前景。

但将MSCs广泛应用于临床，尚需要我们关注以下一些方面的问题。首先，移植的MSCs在肝脏疾病发生进展过程中具体的生物学行为，如移植术后的定位跟踪及体内分化，细胞是否在体内长久存留的可能致瘤性，以及是否容易受HBV感染而发生整合等。其次，探讨更具有优越性的干细胞来源。BMSCs目前仍是干细胞移植应用最多的细胞，但脂肪来源和脐带来源的MSCs被证实也可作为肝脏疾病干细胞疗法的种子细胞，并具有相应的优点。如脐带干细胞来源广泛，体外扩增简单高效，不失为MSCs的一种良好来源。第三，干细胞疗法的具体治疗策略的确定。干细胞输注途径、细胞数量和治疗时间的选择等都对干细胞疗法的有效性有至关重要的意义，如最佳治疗时机的选择，在肝纤维化早期运用干细胞疗法进行干预，可能会逆转或改善纤维化进程，阻止疾病的恶性进展，从而达到较好的治疗效果。第四，开展基因修饰干细胞的基础研究，可诱导多能干细胞的问世，使得干细胞疗法的前景更加美好。最后但非常重要的是，应强调干细胞临床应用的法规和行业准入制度，以保证临床研究和临床治疗能够遵循相应的临床实验准则，从而保证患者的利益。

目前的临床试验结果显示出，MSCs在终末期肝病治疗方面的良好效果，因此，随着大规模和更加严谨的临床研究的进一步验证，MSCs疗法无疑会成为终末期肝病治疗方法的另一选择。

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