冬枣基因改良的研究

高秋名

（山东省滨州市高新区小营街道办事处林业站，山东 滨州 256623）

1 引言

冬枣是鲜食枣果中的珍品，作为我国特有的晚熟鲜食果品，具有很高的营养价值和市场开发前景。冬枣果肉富含人体所需的多种氨基酸和维生素，尤以维生素C含量最为丰富，同时还含有环磷酸腺苷和鸟磷酸腺苷等物质。冬枣成熟期集中，贮藏期短，常温下仅能保存6～7d，目前冬枣采后保鲜主要采用常温、低温、气调、湿冷及冰温、冷冻和防腐保鲜等方法，但果实出库后品质不佳，货架期也只有35d。如何在保持果品鲜食品质的前提下延长贮藏期，是果实遗传改良中亟待解决的问题之一，基因工程技术的利用为此开辟了一条新途径。

2 果树遗传转化研究概况

果树多为多年生木本植物，世代周期长、杂合性高、自交不亲和与遗传背景复杂等特点给木本果树的有性杂交育种带来重重困难。但无论从提高经济价值的角度，还是从提高营养价值的角度来说，培育果树新种质都具有重要意义。植物基因工程技术为果树育种提供了新途径，基因工程技术具有传统育种不可比拟的优势，包括定向改良植物性状；多采用离体繁殖材料，取材不受季节限制，可大大缩短育种周期；利用基因工程技术对果树进行遗传改良，一旦获得转基因植株，且目的基因表达出所需性状，即可通过组织培养、扦插或嫁接等无性繁殖方式对转基因植株进行扩大繁殖，由于不通过有性繁殖，因而个体间性状一致。由于枣树组织培养植株再生的难度较大，缺少合适的再生体系，与其他果树遗传转化相比进展缓慢。

2.1 果树遗传转化受体系统

植物遗传转化的受体系统应具备高效稳定的再生能力，稳定的外植体来源、较高的遗传稳定性和对选择剂敏感等条件。目前，应用于植物遗传转化的受体系统包括直接分化芽系统、胚状体受体系统、愈伤组织受体系统、原生质体受体系统和种质系统。在木本果树上应用较多的为直接分化芽系统和胚状体受体系统。直接分化芽系统的外植体细胞不经过愈伤组织的形成而直接分化不定芽，特别是由茎尖分生细胞建立的直接分化系统具有很好的遗传稳定性。该方法更适于无性繁殖的果树、花卉等。如在柑橘类的遗传转化中多采用茎段、胚轴等作为受体，通过诱导不定芽再生植株。

胚状体受体系统在果树遗传转化中应用较为广泛；果树上第一例获得成功的报道，即是以核桃胚状体细胞为受体再生出转基因植株。

原生质体作为“裸露”的植物细胞同样具有全能性，在适当的培养条件下可再生出植株，因此也是理想的遗传转化受体系统；而木本果树原生质体再生植株周期长，技术难度大，因此，在果树上以原生质体为受体进行遗传转化的报道较少。

种质系统是指以植物的生殖细胞，如花粉粒、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。果树一般是高度杂合体，如果利用花粉粒、卵细胞为受体必经过纯合加倍过程，这样会导致原有优良性状的丢失。

许多果树建立高效的愈伤组织诱导体系比较困难，因此愈伤组织受体系统的应用受到了限制。从再生植株变异程度等角度比较而言，直接分化系统和胚状体受体系统具有较大的优势。因此，在外植体再生植株过程应尽量越过愈伤组织阶段，通过直接分化不定芽或胚状体途径建立高效稳定的再生体系。

2.2 果树遗传转化方法

2.2.1 农杆菌介导法

在众多的植物转基因方法中，农杆菌介导法以其简便、高效和机制研究最为清楚等特点成为应用最广泛的方法。大多数果树对农杆菌感染敏感，此法的应用可收到良好效果。在农杆菌介导的果树遗传转化中，农杆菌菌株和生长时期、植物受体的再生能力及基因型的依赖性是制约转化效率的主要因素。在苹果、柑橘、梨、蔓越桔和杏的研究中发现，EHA101及其衍生而来的菌株EHA105较LBA4404菌株具有更强的转化能力。农杆菌介导植物细胞转化时，只有感受态细胞即处于活跃代谢期或分裂期的细胞才能被转化，因此在果树遗传转化过程中经常采用预培养、创伤外植体等方法以获得状态良好的受体，从而提高转化效率。Bondt等人发现，gus基因的瞬时表达和gus基因的稳定表达之间不呈现良好的相关性。

2.2.2 基因枪轰击法

基因枪轰击法是利用包被有外源DNA的金属微粒，通过高速轰击将外源基因导入植物细胞、组织和器官。Fitch等以番木瓜的合子胚为受体，通过基因枪轰击法将番木瓜环斑病毒外壳蛋白（PRVCP）基因导入受体细胞，再生出转基因植株。Bechker等以香蕉胚悬浮细胞为受体，利用基因抢轰击法进行了转化，获得了转基因植株。一些研究小组在基因枪轰击法和农杆菌介导法配合使用上做了有益尝试。Scorza等利用基因枪轰击无核葡萄体细胞胚2次，然后将体细胞胚与农杆菌共培养，获得了转基因植株。May等以香蕉茎尖为受体，先用基因枪轰击组织，造成微小创伤；再用农杆菌介导法导入gus基因，由转化的茎尖分生组织细胞直接再生出植株。

2.2.3 其他方法

聚乙二醇诱导法、电穿孔法、硅碳纤维介导法等也在果树遗传转化中应用。然而这些方法多以原生质体为受体。木本果树原生质体再生植株周期长，难度大，并且再生植株变异率高，遗传不稳定，因此在木本果树的遗传转化中应用不多。

2.3 基因工程技术在果树改良方面的应用

随着基因工程技术的发展，利用转基因技术改良果树的工作日益受到重视，通过转基因提高果树抗病虫害能力是主要内容之一。在苹果上首次获得成功的遗传转化就是将来自苏云金芽抱杆菌的Bt毒蛋白基因转入苹果，得到了转基因植株。提高果树抗逆性的基因工程研究也取得了阶段性成果，几个研究小组分别获得了耐盐、抗冷的转基因植株。Gao等分别将来自大肠杆菌的胆碱氧化酶（COD）基因和来自苹果的依赖于NADP的6－磷酸山梨醇脱氢酶基因转入日本柿，获得了耐盐的转基因植株。Cervera等将酵母HAL2基因导入柑橘，也获得了耐盐性提高的转基因植株。

在利用转基因技术缩短果树童期的研究也取得了较大进展，Pefia等将来自拟南芥的LEAFY和API基因导入甜橙和积橙，转化植株表现出童期缩短和提早开花的特性，这种性状可遗传给后代，转基因植株的实生苗也表现出童期缩短的性状。

增强果实耐贮性方面的研究主要集中在减少乙烯合成量和延缓细胞壁降解等方面。Silvia等在草墓中表达果胶裂解酶的反义基因，转基因植株的果实在色泽、大小、形状和重量诸方面与对照植株的果实无明显差异，但相对较硬，在后熟过程中硬度的降低速度也相对缓慢。果胶裂解酶基因的表达分析结果显示，转基因植株中的表达量约为对照株的70%。在44个转基因植株中，有33株的产量低于对照，其原因有待研究。不过，从该结果可得出，在延缓果实软化的基因工程中果胶裂解酶基因可看作是一个很好的候选基因。

3 ABA与果实成熟的调控

3.1 ABA在果实成熟过程中的作用

果实成熟是一个复杂的过程，会出现特异性成熟基因的表达和果实细胞代谢的变化，并受内部和外部多种因素的影响。根据果实成熟过程中是否有呼吸跃变，可将果实分为呼吸跃变型和非呼吸跃变型。ABA在上述两类果实的成熟过程中发挥着不同的调控作用。

在呼吸跃变型果实的成熟过程中，ABA可能作为果实“原初启动信使”，通过影响果实乙烯合成来调控果实的成熟。陈昆松等发现，猕猴桃果实后熟过程中，ABA积累出现在果实后熟前期，而乙烯跃变发生在果实后熟中后期，乙烯加速了果实软化的进程，但与软化启动过程无明显关系，说明ABA在猕猴桃果实后熟过程中起着启动和调控作用。陈尚武等的研究结果表明:苹果果实发育后期及成熟期果实内源ABA浓度升高，成熟期果实乙烯合成速率与果实内源ABA浓度呈现明显的正相关，用ABA合成抑制剂fluridone处理苹果果实后，果实内源ABA浓度显著降低，乙烯跃变推迟，推测ABA可能是苹果果实成熟过程中位于乙烯上游的内源调控因子。

作为调控果实成熟的重要激素，ABA在非呼吸跃变型果实中起着比乙烯更为重要的作用。Oavies等使用生长素类似物处理葡萄果实，导致果实成熟启动推迟2周，而ABA含量的增加也被相应的推迟，说明ABA对葡萄果实的成熟启动起着重要作用。张有林等以葡萄和鲜枣为材料研究了果实采后贮期ABA含量的变化，发现用ABA合成抑制剂三碘苯甲酸处理葡萄和鲜枣果实，然后低温贮藏，明显抑制了ABA的形成，取得了良好的保鲜效果。另外，外源ABA处理能促进草毒提前成熟。这些结果表明:在非呼吸跃变型果实成熟过程中ABA起主导作用，ABA含量增长发生在果实成熟之前，可认为是ABA的增加诱发了果实成熟的启动。

3.2 betA基因和als突变基因

在高等植物中，甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成，分别由胆碱单加氧酶（CMO）和甜菜碱醛脱氢酶（BADH）催化；在哺乳动物和一些微生物中，则由胆碱脱氢酶（CDH）催化胆碱形成甜菜碱醛，再由BADH催化合成甜菜碱；还有一些微生物如球形节杆菌和滋养节杆菌中，胆碱可不经过甜菜碱醛而在胆碱氧化酶（COD）的催化下直接生成甜菜碱，到目前为止COD只在微生物中发现。大肠杆菌的CDH由betA基因编码，能催化胆碱形成甜菜碱醛，也能催化甜菜碱醛脱氢产生甜菜碱，只是催化后一步的效率较低，即兼具胆碱单氧化物酶和甜菜碱醛脱氢酶的功能，这使转移单一基因就可使植物合成甜菜碱成为可能。Lilius等（1996）将betA基因转入烟草，转基因植株的耐盐性比对照植株有明显提高。

20世纪80年代中期，人们已成功地从拟南芥和烟草的抗除草剂植株及野生型植株中克隆出als基因。Haughn等通过诱变技术得到表现除草剂抗性的拟南芥突变系。用野生型拟南芥als基因为探针从除草剂抗性株系的基因组文库中分离到突变als基因。als基因编码乙酞乳酸合成酶（acetolactate synthase，ALS），该酶是Leu，IIe和 Val合成途径中的第一个酶，是磺酸脉类除草剂的靶酶。磺酞脉类除草剂是一类较新的广谱性除草剂，其特性是高效和对哺乳动物的低毒性。细菌、真菌和高等植物都显示了对这类除草剂的敏感性。哺乳动物并不利用分支氨基酸合成途径，而是通过食物获得分支氨基酸，因此磺酰脲类除草剂对哺乳动物是低毒或无毒的。由于突变的als基因对磺酰脲类除草剂的高抗性，以及磺酰脲类除草剂的广谱高效性和对哺乳动物的低毒性，其已被应用于农作物的遗传转化研究中，培育抗除草剂作物已成为作物育种的一个重要方面。在果树上，Yao等将突变的als基因转入苹果栽培种嘎娜，获得的再生植株表现为对磺酞脉类除草剂的抗性。

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