胃腺癌组织中HDGF、VEGF的表达及意义

马桂芳，李惠芬，杨 李

（盐城卫生职业技术学院，江苏盐城 224006）

胃腺癌是中国较常见的消化道恶性肿瘤，死亡率居各种癌症之首。近年来，随着分子生物学的不断发展，发现细胞增殖、凋亡异常及新生血管形成等与肿瘤的发生、发展密不可分，在这个过程中有多种因子参与或影响了肿瘤的浸润和转移。肝癌衍生生长因子（hepatoma derived growth factor，HDGF）是Nakamura等［1］从肝癌细胞系HuH－7培养液中分离出的一种酸性肝素结合蛋白。众多国内外的研究表明HDGF的过表达与一些恶性肿瘤的侵袭、转移及预后紧密相关。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前知道作用最强的促血管生长因子，它能增加血管的通透性，引起细胞外基质的改变，促进血管形成，对肿瘤细胞的增殖和迁移等发挥着重要的作用，它是独立预后指标。本研究采用免疫组织化学方法检测胃腺癌组织中HDGF、VEGF蛋白表达情况，为肿瘤的联合治疗寻找新的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集盐城市第一人民医院病理科2011年1月至2011年12月手术切除并经病理检验证实的胃腺癌石蜡标本47例，另取同期胃黏膜不典型增生组织标本15例及因胃良性病变行部分胃切除的正常胃黏膜标本10例作对照。47例胃腺癌患者标本的选择分别从年龄、性别、分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移、TNM分期等方面考虑，所有患者术前均未接受放疗、化疗。

1.2 主要试剂 HDGF兔抗人多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司产（bs－6537R），一抗工作液浓度1∶100；抗体稀释液为北京博奥森生物技术有限公司产品；VEGF鼠抗人单克隆抗体即用型（MAB－0243）、二抗及DAB显色液均为福州迈新生物技术公司产品。

1.3 免疫组化染色方法 采用链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶连结法（S－P）检测胃腺癌及正常胃黏膜组织中HDGF和VEGF蛋白的表达，具体操作步骤按说明书进行。将存档的石蜡块行4μm厚切片，常规脱蜡至水。切片置已加热沸腾的PH6.0柠檬酸缓冲液中，继续微波加热15min修复抗原，然后用3%过氧化氢去离子水37℃孵育15min，以消除内源性过氧化物酶活性。一抗37℃孵育60min，后4℃过夜，二抗37℃孵育45min，链霉素抗生物素过氧化物酶37℃孵育45min，DAB显色，苏木素复染。用已知的HDGF和VEGF阳性的胃腺癌切片染色作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定 HDGF蛋白以细胞核（少数细胞质）内出现棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性；VEGF蛋白以细胞质内出现棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性。每份标本置高倍镜下选取5个不同视野，每个视野计数200个肿瘤细胞，由2位病理科医师进行盲法判读，计算阳性肿瘤细胞所占的百分数。结果分为4级：未见明显阳性细胞为“－”；阳性细胞数＜25%为“＋”；25%～50%为“＋＋”；＞50%为“＋＋＋”。

1.5 统计学处理 采用SPSS19.0软件包进行分析，HDGF与VEGF蛋白表达与胃腺癌临床病理参数的关系用χ2检验，HDGF与VEGF在胃腺癌中表达相关性用Spearman进行相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HDGF、VEGF蛋白在胃腺癌和正常胃组织中的表达HDGF蛋白在胃腺癌组织中阳性染色主要定位于细胞核，少数在细胞质，为棕黄色或棕褐色颗粒（封3图1）。HDGF在胃腺癌组织中的阳性表达率为65.9%（31／47），低级别上皮内瘤变组织33.3%（5／15），正常胃黏膜组织20%（2／10）。结果显示，HDGF蛋白在胃腺癌组织的表达高于低级别上皮内瘤变组织（χ2＝4.970，P＜0.05）和正常胃黏膜组织（χ2＝5.383，P＜0.05）。VEGF蛋白阳性染色主要定位于细胞质，为棕黄色或棕褐色颗粒（封3图2）。VEGF在胃腺癌组织中的阳性表达率为68.2%（32／47），低级别上皮内瘤变组织20%（3／15），正常胃黏膜组织10%（1／10）。结果显示，VEGF蛋白在胃腺癌组织的表达明显高于低级别上皮内瘤变组织（χ2＝11.879，P＜0.01）和正常胃黏膜组织（χ2＝10.125，P＜0.01）。

2.2 HDGF、VEGF蛋白表达与临床病理参数的关系 胃腺癌组织中HDGF蛋白和VEGF蛋白表达都与肿瘤浸润的深度、临床TNM分期、淋巴结转移相关（P＜0.05），差异有统计学意义；而与患者年龄、肿瘤大小、肿瘤组织分化程度无明显的相关性（表1）。

表1 胃腺癌HDGF与VEGF蛋白表达与临床病理参数关系

2.3 胃腺癌组织中HDGF和VEGF表达的相关性 在31例HDGF阳性的胃腺癌组织中，VEGF阳性者25例，占80.6%；16例HDGF阴性胃腺癌组织中，VEGF阳性者7例，占43.8%，γ＝0.375，P＜0.01，相关分析表明，胃腺癌组织中HDGF蛋白的表达与VEGF蛋白表达呈正相关。

3 讨 论

HDGF结构上类似于高迁移率族蛋白－1（HMG－1）的氨基酸序列。近年来，随着对HDGF的功能研究不断深入，发现HDGF对细胞增殖、组织器官生长发育、血管生成、创伤修复［2］等生物学行为有着重要的影响，而且在肝癌［3］、非小细胞肺癌［4］、结肠癌［5］、胃癌［6］、胰腺癌［7］、食管癌［8］等多种肿瘤中呈过表达，且与患者的预后密切相关。本研究采用免疫组织化学方法检测胃腺癌组织、胃黏膜不典型增生组织及正常胃黏膜组织中HDGF蛋白表达情况，发现胃腺癌组织中的HDGF蛋白表达水平明显高于胃黏膜不典型增生组织及正常胃黏膜组织中的HDGF表达，提示HDGF异常的高表达参与胃腺癌的发生和发展。Yamamoto等［6］应用免疫组织化学检测317例胃癌组织中HDGF表达情况，研究发现胃癌组织中HDGF 1级182例，2级135例，HDGF指数水平2级病例肿瘤体积均较大，多呈侵袭性生长，血管转移和淋巴转移率均较HDGF指数水平1级的病例高，且HDGF指数水平2级的患者5年生存率较1级低。本研究结果显示，胃腺癌组织中HDGF的表达水平随患者临床分期增加而增加，而且在伴有淋巴结转移的胃腺癌组织中HDGF的表达明显高于无淋巴结转移的HDGF的表达，与文献报道基本一致，提示HDGF蛋白高表达在胃腺癌的发生及转移过程中可能起重要作用。

肿瘤要不断生长，就必须有新生血管形成，而且肿瘤血管也是肿瘤转移的病理基础。目前，已知的促血管生成的因子有VEGF、FGF、COX－2等，其中 VEGF的作用最强，它在肿瘤新生血管形成以及肿瘤的生长、浸润及转移中起重要作用［9－11］。其通过诱导内皮细胞增生，蛋白酶的表达，抗内皮细胞凋亡和细胞重组，最终形成毛细血管，并且能够增加血管的通透性，形成不成熟的血管网络［12］。VEGF广泛分布于体内各组织，如脑、垂体、肾脏、肾上腺和卵巢等［13］。近年来，VEGF与恶性肿瘤的关系受到重视，开展了较多研究，发现恶性肿瘤组织VEGF表达上调，能促进肿瘤血管形成，是肿瘤产生、发展和转移过程中极为关键的步骤［14］。本研究结果显示，胃腺癌组织、胃黏膜不典型增生组织及正常胃黏膜组织中VEGF蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.01），与文献报道基本一致，提示VEGF为肿瘤的生长提供物质基础。

本研究结果显示，胃腺癌组织中HDGF蛋白的表达与VEGF蛋白表达呈正相关（P＜0.05）。Okuda等［15］通过构建稳定高表达重组的HDGF的成纤维细胞株NIH3T3（HDGFNIH3T3），将HDGF－NIH3T3注入裸鼠体内后形成肉瘤，经观察显示此肉瘤组织中有丰富的血管形成。进一步用CD31抗体进行免疫组织化学分析显示有新生血管生成及VEGF的表达增强，提示在胃腺癌中HDGF可能通过诱导VEGF的生成而参与肿瘤血管形成的调节，而HDGF诱导VEGF生成的机制，可能是由于HDGF能够增强VEGF启动子活性或直接与VEGF基因的结合域结合，促进VEGF的转录合成［15］。本研究与文献报道基本一致，提示HDGF和VEGF的过表达与胃腺癌的发生、发展密切相关，可能在胃腺癌的发生、发展及转移过程中起到协同的促进作用。

但二者之间确切的信号转导途径及在胃腺癌形成中的作用、地位仍需进一步研究，为胃腺癌的诊断和评价预后提供一个新的更有效的指标，也为胃腺癌的靶向治疗提供新的方案。

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