H1和H3亚型禽流感病毒二重PCR 检测方法的建立

郭 捷，谢芝勋，彭 宜，刘加波，谢志勤，庞耀珊，邓显文，谢丽基

（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530004；2.广西壮族自治区兽医研究所 广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁530001）

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科（Orthomyxoviridae）A型流感病毒属中不同亚型病毒引起的禽类感染和疾病的总称。禽流感病毒（AIV）为单股负链RNA病毒，由8个独立的RNA节段组成，根据其表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性差异，可分为16个HA亚型和9个NA亚型。其中H1和H3亚型AIV虽然属于低致病性AIV，在禽类中没有表现出明显症状，较少出现死亡，但在人类流感中H1和H3亚型流感病毒引起过世界性的大流行［2］，20世纪全球发生过3次流感大流行都是由H1亚型或H3亚型流感病毒造成的，尚且不能证明这几次大流行流感的2种亚型病毒来自于禽类，但可以推断禽源H1和H3亚型AIV为人类流感病毒提供了基因片段，从而间接的威胁着人类的身体健康，具有重要的公共卫生意义［3-7］。所以，建立同时快速检测H1和H3亚型AIV的方法，对这两种亚型禽流感病毒感染的诊断和控制非常关键。

目前对H1和H3亚型AIV感染的鉴别诊断主要依靠传统的病原分离鉴定与血清学试验，这些方法有一定的局限性，不能同时检测出这两种亚型AIV。因此，本研究选择一种具有敏感性高、特异性好、快速、简便的PCR检测方法用于鉴别诊断H1和H3亚型禽流感病毒感染。相对于单项PCR技术，二重PCR技术能同时检测并鉴别出两种病原体，在临床上具有很高的应用价值。此方法已被广泛应用于一些病原微生物的检测中，并且具有良好的敏感性和特异性［8-12］。本试验的目的在于建立一次PCR反应就能同时检测和鉴别H1和H3两种亚型禽流感病毒的二重PCR方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 H1、H3、H6、H9亚型AIV由广西畜禽疫苗新技术重点实验室分离鉴定；H5N2、H7N2亚型AIV RNA由美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室惠赠；新城疫病毒（NDV）F48、传染性支气管炎病毒（IBV）M41、传染性喉气管炎病毒（ILTV）北京株及鸡毒支原体（MG）86由广西畜禽疫苗新技术重点实验室保存提供。

1.1.2 试剂 RNA提取试剂Trizol LS Reagent为Invitrogen公司产品；AMV反转录酶、dNTP为宝生物工程（大连）有限公司产品；DU 800紫外分光光度计为Beckman Coulter公司产品；SPF鸡胚购自北京梅里亚公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank已发表的H1亚型和H3亚型AIV-HA基因的保守核苷酸序列，应用DNA Star软件和Primer 5.0生物软件设计针对H1亚型和H3亚型AIV基因序列的2对特异性引物，其中H1亚型AIV扩增302bp，H3亚型AIV为626bp，引物核酸序列见表1。引物由Invitrogen公司合成，储存液浓度为50pmol／μL，置-30℃保存备用。

1.2.2 病毒RNA抽提与反转录 参照Trizol LS Reagent使用说明书和文献［10］进行病毒RNA抽提，向抽提后的RNA中加入35μL DEPC水和1.5 μL反转录引物：70℃10min，冰浴5min；加入反转录体系：10μL 5×M-Mulv buffer、2μL dNTP、0.5 μL RNA酶抑制剂、1μL AMV，瞬时离心，42℃经90min。制备的cDNA置-30℃保存备用。

表1 H1和H3引物的核苷酸序列Table 1 Nucleotide sequences of H1and H3primers

1.2.3 二重PCR扩增条件的优化 总反应体积为25μL，其中2×PCR Master Mix 12.5μL，H1亚型AIV cDNA和H3亚型AIV cDNA共2μL作为混合模板，引物 H1-F、H1-R各加入0.4μL，H3-F、H3-R各加入0.6μL，最后用双蒸水补至25μL。对二重PCR的各引物浓度及PCR反应的各参数（温度、时间）进行优化，以筛选出二重PCR反应体系中最佳的反应模式。

1.2.4 二重PCR的特异性试验 利用本研究优化好的二重PCR反应体系，同时扩增H1、H3、H5、H6、H7、H9亚型 AIV、NDV、IBV、ILTV 及 MG的核苷酸进行检测，检验其特异性。

1.2.5 二重PCR的敏感性试验 将制备好的H1 AIV和H3AIV RNA按10倍倍比稀释，利用Beckman UV-800紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的RNA浓度，反转录后采用最佳引物浓度和二重PCR反应模式，分别对上述模板进行二重PCR扩增以检测其敏感性。

1.2.6 临床样品检测 应用所建立的PCR方法，对17份从广西南宁市活禽市场采集的口腔和粪便拭子进行RNA提取，反转录后进行检测。

2 结果

2.1 二重PCR条件的优化

通过对H1亚型AIV、H3亚型AIV 2种引物浓度的测定及二重PCR扩增的温度、时间等的优化，最后确定二重PCR最佳反应体系：2×PCR Master Mix 12.5μL，H1亚型AIV上下引物（50 pmol／μL）各0.1μL，H3亚型 AIV 上下引物（50 pmol／μL）各0.4μL，混合模板2μL，加水至25μL。二重PCR的最佳反应模式为：94℃4min；94℃50 s，56℃50s，72℃ 1min，35个循环；72℃10min，4℃结束反应。其PCR反应产物用10g／L琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果并拍照。

2.2 特异性试验结果

特异性试验结果显示，含有H1亚型AIV、H3亚型AIV的核酸样品均能扩增出与试验设计大小相符的302bp和626bp 2个明亮条带，与预期结果一致（图1）；而其他亚型流感病毒和禽呼吸道疾病病原均未扩增出任何条带，说明该方法有较好的特异性。

图1 二重PCR的特异性试验结果Fig.1 Specificity results of duplex PCR

2.3 敏感性试验结果

用Beckman UV-800紫外分光光度计测得H1亚型AIV和H3亚型AIV总RNA浓度分别为500 ng／μL、260ng／μL，应用优化后的二重PCR方法对10倍梯度稀释的H1亚型AIV、H3亚型AIV核酸模板进行检测，结果表明，该二重PCR最低能同时检测到50pg的H1亚型AIV和26pg的H3亚型AIV核酸模板（图2）。

图2 二重PCR的敏感性试验结果Fig.2 Sensitivity results of duplex PCR

2.4 临床样品检测结果

在广西南宁市17份活禽市场样品中，抽提RNA反转录后进行二重PCR检测，结果有4份为H1亚型AIV阳性，5份为H3亚型AIV阳性（图3），与病毒分离鉴定的结果一致。

3 讨论

AIV 16种HA亚型中，H1亚型和H3亚型属于低致病性禽流感病毒，但在人类流感病毒中，自1997年起，H1N1型与H3N2型在人群中交替流行，严重影响了人类的身体健康［13-15］，其中的基因片段有可能来自于禽流感的H1和H3亚型。因此，本研究针对H1亚型AIV-HA基因和H3亚型AIV-HA基因，设计2对特异性引物，使该PCR反应能同时扩增出针对H1亚型和H3亚型AIV的目的片段，对我国现有H1亚型和H3亚型AIV的检测有十分重要的意义。

图3 二重PCR检测临床样品的结果Fig.3 The detection results of clinical samples by duplex PCR

因为感染H1和H3亚型禽流感病毒的禽类不会表现明显的临床症状，也很难通过病理组织变化观察进行鉴定。另外，传统的血清学检测方法敏感性不高。本研究所建立的二重PCR，对含有H1亚型AIV毒株、H3亚型AIV毒株进行了二重PCR检测，结果均同时得到了与试验设计大小相符的扩增条带，而对其他对照病毒的扩增结果均为阴性，说明本试验所建立的二重PCR特异性良好。同时，利用扩增片段长度大小的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定上更加直观、简便。另外，敏感性试验结果表明，该二重PCR最低能同时检测到50pg H1亚型AIV模板，26pg H3亚型AIV模板，可以看出该二重PCR方法敏感性较高。通过临床检测，也体现出来该二重PCR方法的高度准确性和简便性。

综上所述，本研究所建立的二重PCR方法，对同时鉴别检测H1亚型AIV和H3亚型AIV具有简便快速、特异性好、灵敏度高等特点，为H1和H3亚型禽流感的诊断和监控提供了技术手段。

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