HA混合生物玻璃制备TCP陶瓷支架及其性能的研究

郑 卫

(温岭工业园区管委会，温岭 317500)

引言

在过去的十年里，骨组织工程学已经成功作为处理骨修复的一种重要方法[1]。磷酸钙陶瓷与骨骼成分相似且具有优良的生物特性，包括生物兼容性、骨传导性、骨诱导性，被作为骨骼修复的重要材料而广泛应用[2]。但是羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)的力学性能制约了其在骨修复中的应用[3-4]。有资料表示，在陶瓷支架中加入少量纤维，或者混合其他生物材料能增加原来陶瓷的力学性能[5]，因此人们开始尝试在HA里面加入生物玻璃来提高HA的力学性能[6]。实验结果表明，生物玻璃能大大提高HA的力学性能，因为其能在烧结过程中液化修补多孔支架裂痕[7]。同时，当生物玻璃的量为2.5～5%时(质量比)，在一定温度下烧结，HA支架中会有磷酸三钙(tricalcium phosphate，TCP)出现[8-9]，而烧结温度和生物玻璃的量正是控制HA转化成TCP的关键因素。Nezahat等人[3]在文献中指出当HA加入5%生物玻璃时，在烧结过程中会有很多相位变换，而TCP就是其中之一。磷酸三钙以其良好的生物活性与生物可降解性，在骨组织工程学中的应用逐渐得到重视。但TCP制作较HA复杂，因此笔者以HA与生物玻璃为原材料制作TCP支架，不但减少TCP制作的繁冗工序，而且以此方法制得的TCP支架的力学性能将远远超过以粉末制得的TCP支架。而生物玻璃与羟基磷石灰的混合比以及灼烧陶瓷的温度是制作TCP支架的关键环节。

1 材料和方法

1.1 材料

采用塑料制作8 cm×8.5 cm×8.5 cm陶瓷支架的牺牲支架，塑料支架的熔点为105℃[10]。支架中每根管的直径为1 mm，两管间的空隙设计为1.5 mm(图 1)。

图1 大管支架3D成型图Fig.1 3 D macro-tube scaffold

在生物玻璃与HA混合溶液中，加入一定量的聚乙烯醇(PVA)和磷酸三乙酯(TEP)，最后加入少量水使之成为粘稠状，并搅拌1 h使混合物均匀混合。将塑料支架放入蜡溶液中，接着放入 HA/Bioglass混合物中等充分浸透并干燥后，在1400℃下灼烧3 h而制得 TCP生物陶瓷支架，其中PVC、TEP、塑料支架都会在高温下分解。表1是为了研究不同含量的混合物(生物玻璃/HA)在不同温度下烧结所得的支架的成分。实验中所用试剂为Sigma公司产品。

表1 不同生物玻璃的含量在不同温度下烧结Tab.1 Different sintering temperature and the bioglass additions

1.2 支架的表征

1.2.1 支架的孔率

孔隙率的计算可用以下公式[11]：体积密度(ρB)=样品的质量除以样品的体积;TCP理论密度(ρ0)=2.7 g/cm3;相对密度 =(ρB/ρ0) ×100%;孔隙率=100%-相对密度。

1.2.2 支架的收缩率

支架的收缩率可以用以下公式计算：支架收缩率=(O-F)/O;其中O为原来支架的长度;F为烧结后支架的长度。

1.2.3 微量分析

X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)用于鉴定陶瓷支架的结晶相。电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM)用于观察支架的显微结构、微孔分布以及细胞生长。能谱仪(energy dispersive spectroscopy，EDS)用于分析支架表面生成新物质的化学成分。

1.2.4 力学性能测试

耐压强度是模型测力的一个最主要参数。测力仪器为 Hounsfield Testing Machine(Model：H10K/M527，UK)，而之前被切碎用于观察的模型不能再用。将橡胶垫置于模型两端使其均匀受力，测力器以0.5 mm/min速率压下。

1.2.5 模拟体液分析

模拟体液(simulated body fluid，SBF)的制备是根据Kokubo的文献[12]。表2为模拟体液中各微量元素的含量与真正血液中微量元素的含量。

表2 SBF与血液中各微量离子的含量Tab.2 Ion concentrations of SBF and human blood plasma

支架将会被浸泡在37℃的模拟体液中21 d，每隔7 d更换新的SBF。样品的质量与SBF的体积比(mg/ml)为3∶5。21 d之后，将样品拿出 SBF，在室温下用去离子水清洗，最后进行SEM观察。

1.2.6 生物实验

将支架切碎，取小块(约1 mm3)浸入细胞培养基里(dulbecco's modified eagle medium DMEM)，每个培养基内有约1×105个骨髓干细胞，在37℃，5%CO2下存放一个星期。7 d后，经过一系列的处理，最后用超临界点烘干机烘干后进入电镜观察阶段。MTT实验是为了观察细胞的增殖情况，实验中分成两组，一组的培养基里细胞和支架同时存在;作为比较，另外一组的培养基里只有细胞。

2 结果与讨论

2.1 支架成分确定与显微结构

从表3中可以看到，将20%的生物玻璃加入HA中，经过1400℃的灼烧，能获得TCP陶瓷支架。当温度没有达到1400℃或者生物玻璃与HA的成分比不够的时候，HA在生成TCP的同时，也转化生成了其他磷酸钙盐。

在烧结过程中，不同相的产生是根据温度和时间的变化。当温度在850～1200℃时，HA会经历以下的变化[14-15]：

表3 X衍射分析，当HA加入不等量生物玻璃后在不同温度烧结后下支架的成分Tab.3 XRD phase analysis data for composites of HA with the addition of 10，15，and 20wt%bioglass

当温度上升到1400℃时形成的磷酸钙盐会进一步生成Ca3(PO4)2(TCP)，但是大多数都是α相，而当支架降温的时候α-TCP会变成β-TCP。同时有资料显示，由于弹性应变α相也会保留在相变过程中[16]。因此，最后得到的TCP支架同时含有 α-TCP与β-TCP，这可以用X射线衍射分析证明(图2)。

图2 TCP的衍射分析图。(a)用此方法制得TCP衍射分析(大部分为β-TCP);(b)β-TCP粉末在烧结前(下)后(上)的衍射分析[13]Fig.2 Comparison of XRD patterns.(a)XRD pattern for a sintered porous calcium phosphate(mainly β-TCP)sample;(b)XRD patterns of β-TCP starting powder and sintered body[13]

在图3中可以看到，支架上还有一些不规则的裂痕和小孔。孔产生的原因有4点：(1)难以确定支架内部是否灌实;(2)蜡的升华;(3)陶瓷晶粒的局部团聚;(4)根据化学反应式(1)和式(2)，HA分解有少量水蒸气产生。

裂纹的出现是由于陶瓷晶体的团聚产生，加上ABS塑料在高温下膨胀。蜡的预涂层是为了给ABS塑料的膨胀提供空间，只是预防措施，而不能避免其膨胀，所以在烧结过程中，ABS塑料的膨胀，其力会作用在陶瓷上。同时，在高温下陶瓷会出现收缩现象，两作用力下产生裂纹。

图3 多孔大管支架电镜观察Fig.3 Overview of the macro-tube TCP scaffold

3.2 支架的收缩率与孔隙率

烧结后支架的孔隙率大约为63%，大管是主要造成孔隙率较高的原因。支架的收缩率为28%，其原因在于混合陶瓷会在800℃开始形变收缩，从800℃到1150℃的之间的形变率超过25%，在1150℃后陶瓷基本不发生变化，而随着温度的上升，陶瓷晶粒的增大会引起支架小幅变化。一般情况下，孔隙率的提高会影响支架的力学性能，直接用TCP粉为原料，同样的成形和升温条件下制备多孔TCP块体，在孔隙率相近的情况下，其抗压强度比较本实验方法制备的块体低。生物玻璃在烧结过程中起了重要的作用，首先，作为反应物与HA反应生成TCP，使晶体结构发生改变，晶粒重排，使产物强度提高。

图4 以HA/生物玻璃制得TCP的微观结构。(a)800倍;(b)1600倍Fig.4 SEM micrograph of a fracture surface of the porous TCP showing the presence of micro-pores.(a)800×;(b)1600×

其次从图4可以观察到以HA/生物玻璃为原材料所制备的TCP多孔支架，表面的孔相对以TCP粉末制得的支架的孔(见图5)较少，其原因是生物玻璃在700℃开始融化，随着温度升高生物玻璃液相附在支架表面，填补了部分空隙，使晶体粘接在一起，在烧结后以 TCP晶体附在支架表面，增强了支架的机械强度。

图5 以TCP粉末制得的TCP微观结构Fig.5 TCP microstructure，depicting pore size and surface area[17]

3.3 多孔支架的力学测试

图6 支架的受力曲线图。(a)用HA/生物玻璃制得的TCP支架;(b)用TCP粉末制得的TCP支架Fig.6 Compressive stress-strain curve.(a)Sintered HA/Bioglass made porous TCP sample;(b)Sintered TCP powder made porous TCP sample

图6(a)是用HA与生物玻璃混合制得的多孔TCP支架受力曲线，图中可以看到，支架最大可承受的压强为9.98 Mpa;图6(b)为直接用TCP粉末制得支架曲线，此曲线是多孔结构中典型的脆性破坏曲线，其受压强度为2.96 MPa。表4为正常人体骨骼的骨密质与骨松质的各项参数，可以发现用本实验方法制得的TCP支架虽然没有达到骨密质的强度，但已经可以作为骨松质的替代材料，而孔隙率(63%)也已满足骨松质的要求。因此，此法制得的支架具有良好应用前景。

表4 骨骼的各项基本参数Tab.4 Summary of mechanical properties and porosity of human bone

3.4 支架在模拟体液中的情况

图7 支架在SBF溶液中浸泡21 d后实用电子显微镜观察与支架表面EDS分析。(a)放大4000倍(b)支架表面EDS分析Fig.7 SEM image of the scaffold after soaking in SBF for 21 days(a)4000×;(b)EDS spectra of the surfaces of TCP

图7a是支架在模拟体液(SBF)里浸泡了21天后的结果。在显微镜中可以发现支架表面已变得粗糙，同时可以发现一些小圆球在支架上生成。为了研究这些小圆球的化学成分，对支架表面又进行了能谱分析。分析后的结果见图6(b)，从图中可以看到，这些圆球上含有大量的 P、Ca，而且他们原子成分比大约为1.65，这个特征同样在HA里能发现，因此可以证明此小球为 HA;而只有高生物活性的材料在模拟体液中才能生成 HA[25];因此可以断定用上述办法制得的TCP支架拥有很高的生物活性。

3.5 生物实验

3.5.1 细胞生长观察

将支架浸入含有骨髓干细胞的悬浮液(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)中，可以发现，可见部分细胞粘附在材料表面，细胞的长势良好，形态非常正常，呈现了良好的生物相容性。同时也出现了一些圆球状晶状体，经材料表面沉积物的EDS分析此为磷酸钙盐。它对骨的形成和生长非常有利，此现象也证明了材料的生物学性能良好(图8)。

图8 细胞在TCP支架上的生长状况。(a)2000倍;(b)500倍Fig.8 SEM micrograph shows the attachment of the cells on TCP ceramic strut surface.(a)2000×;(b)500×

经过分析，有两种可能会导致这样的情况发生，首先是这个溶液含有牛血清，里面含有一定的与SBF相同的离子，其次TCP支架在培养基中也慢慢释放出P、Ca离子，形成了SBF溶液，支架在浸放了21 d后，表面出现磷酸钙盐晶体。为了研究此晶体的形成与细胞的关系，作为比较，将支架浸入无细胞的培养基内，经过21 d的浸泡，在没有细胞的情况下，此晶体同样会出现(图9)。因此，磷酸钙盐晶体的形成与细胞的存在没有关系。

图9 TCP支架在培养基里浸泡后Fig.9 SEM micrograph showed the TCP ceramic scaffold immersed into the medium without cell

3.5.2 细胞增殖实验

用甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制情况是评价材料有无毒性的一个重要手段，图9为通过9 d的培养细胞的增殖情况，在阴性对照组中，培养基里有同样数量的细胞，在同样的环境条件生长。在图中可以看到通过9 d的培养，两组细胞都有明显的增长，但是在前6 d有TCP组的增长速率明显快于对照组，而6 d后细胞增长速率大致相同。因此，用上述办法制得的TCP不但没有毒性，而且展示了良好的生物相容性。

图10 细胞增殖实验结果，误差线为平均值±标准偏差，n=3Fig.10 MTT assay for proliferation of hBMSCs and hBMSCs combined with TCP scaffolds at different incubation periods under the same culture condition.Error bars represent mean±SD for n=3

4 结论

较之用TCP粉末直接制得的TCP支架，以HA与生物玻璃为原材料制得的TCP陶瓷支架不仅具有良好的力学性能，更接近正常骨骼所需要的强度，而且该支架材料能促进细胞增殖，观察细胞长势良好，表现出良好的生物相容性，用HA和生物玻璃来制作TCD支架是将来骨修复的一个重要研究方向。

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