鸡禽流感（H5＋H9）二价灭活疫苗免疫程序探讨

朱刚毅，刘宝有，陶正泽，邢四仙，王兆美，张明芬，李盛达

（云南省江川县畜牧局，云南 江川 652600）

在每年春秋两季的重大动物疫病免疫抗体监测中，我们发现，少部分蛋鸡场的商品蛋鸡一个饲养周期只注射过2次禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗，但在商品蛋鸡淘汰时（540日龄左右）采血检测禽流感H5亚型和H9亚型病毒免疫抗体效价，抗体合格率（≥5log2）还在90%以上。目前商品蛋鸡场疫苗防疫种类繁多，如果单用禽流感H5、H9单价灭活疫苗免疫商品蛋鸡，一个饲养周期禽流感疫苗就得注射6～8针。对此，我们用禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗分别对两组商品蛋鸡1次性免疫和2次性免疫注射后，定期采血进行HI抗体效价跟踪检测；并对只做2次禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗的一个商品蛋鸡场的三批蛋鸡作了禽流感免疫抗体效价和禽流感病毒抗原快速检测的调查。旨在探索一种简便、安全有效的蛋鸡禽流感的预防免疫程序。报告如下。

1 材料与方法

1.1 禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗（H5N1Re-5+H9N2Re-2株） 由农业部批准的某禽流感生产厂家生产。H5亚型和H9亚型禽流感标准抗原及阳性、阴性血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生产。禽流感病毒抗原快速检测试剂盒：BioN-ote，lnc生产，罗曼动物保健有限公司经销。

1.2 试验鸡分组 1日龄的海蓝褐商品蛋鸡600只。分为A、B两组，A组为1次性免疫组；B组为2次性免疫组，每组300只，由某商品鸡场在相同环境中饲养。

1.3 免疫预防方法 15日龄A、B两组每只鸡颈部皮下注射禽流感H5+H9灭活疫苗0.3mL。B组至96日龄每只鸡再注射禽流感H5+H9灭活疫苗0.5mL。其他疫苗按常规免疫方法进行。

1.4 血清样品采集 采血日龄为A组：8、12、21、29、36、66、97、127、150；B 组 8、12、21、29、36、66、97、127、150、181、211、241、271、301、331、361、391、421、451、481、511、541。每组试验鸡随机抽样30只，每只鸡用1次性2.5mL塑料注射器翅膀下静脉采血1.5mL，分离血清，冷冻保存备检。

1.5 抗体效价检测 按《中华人民共和国国家标准-高致病性禽流感诊断技术》GB／T18936-2003）规定的操作规范进行血凝试验、血凝抑制试验（HAHI）检测H5亚型和H9亚型禽流感抗体效价［4］，每组求取抗体效价平均值，绘制坐标图（见图1）。A组测致平均抗体效价＜5log2，B组测致541日龄（老鸡淘汰）。试验结束。

1.6 被调查商品蛋鸡场的调查方法 在某一商品蛋鸡场选择了3批商品蛋鸡，禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗只免疫过2次，首免时间为14～17日龄，二免时间为90～110日龄；每批为每批为3000～5000只，商品蛋鸡淘汰前（520～540日龄）每批随机抽样30只，每只鸡用1次性2.5mL塑料注射器翅膀下静脉采血1.5mL，分离血清，冷冻保存备检禽流感免疫抗体效价。每只鸡采血后用禽流感病毒抗原快速检测试剂盒中的样品采集拭子插入鸡喉头擦拭几次后，抽出采集拭子放入样品管，与样品管中的液体充分混合，一只样品管液混合5只鸡的采集拭子；再用1次性滴管吸取样品管中混合好的上层样品液，滴入4～5滴样品到试纸条样品孔，室温水平放置试纸条20～30min内，判定结果。禽流感病毒抗原的判定标准为 ：阳性：试纸在C区和T区位置出现平行的紫红色（或红色）线；阴性：试纸只在C区位置出现一条紫红色（或红色）线；无效：试纸不出现任何线。

2 结果

2.1 A组（1次性免疫组）禽流感H5+H9灭活疫苗免疫7d后禽流感抗体效价开始回升，免疫后15日H5、H9抗体效价平均值分别为6.07log2、6.05 log2，21日 H5、H9抗体效价平均值分别为7.32 log2、7.79log2，达峰值；H5、H9免疫后112日抗体效价平均值分别为6.21log2、6.62log2（≥5log2），抗体合格率100%，往后逐渐下降 ，到免疫后135日，H5、H9抗体效价平均值分别只有3.64log2、3.81log2（＜5log2）。H5、H9亚型HI抗体消长规律同步，离散度较小（见图1）。

2.2 B组（二次性免疫组）禽流感H5+H9灭活疫苗二免（96日龄）前禽流感H5+H9抗体效价平均值以A组相近，二免后第30天达峰值 ，分别为11.05log2和11.62log2，持续1个月后缓慢下降。二免后445d（541日龄），禽流感H5+H9抗体效价平均值分别为6.51log2、6.8log2（≥5log2），免疫合格率86.7%。H5+H9亚型HI抗体消长规律同步，离散度稍大（见图2）。

2.3 A、B两组首免前的8日龄雏鸡禽流感H5+H9母源抗体效价平均值维持在7.35log2～7.82 log2之间。12日龄母源抗体效价平均值则下降致3.01log2～3.72log2（＜5log2）。

2.4 被调查商品蛋鸡场的蛋鸡禽流感调查结果（见表1）。

表1 商品蛋鸡场的蛋鸡禽流感调查结果

3 讨论

3.1 用禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗免疫商品蛋鸡，产蛋前免疫未见到明显的不良反应，免疫效果确实有效。15日龄1次性免疫组免疫后112d，检测禽流感病毒H5、H9亚型HI抗体效价平均值都在6log2以上（＞5log2），免疫合格率100%，到免疫后135日，H5、H9抗体效价平均值在5log2以下（＜5log2），免疫保护期只能维持4个月左右［3］，与使用说明书和吴艳涛等报道相似。

3.2 15日龄、96日龄二次性免疫组二免后445d（541日龄），检测禽流感病毒H5、H9亚型HI抗体效价平均值仍在6log2以上，免疫合格率86.7%，免疫保护时间比1次性免疫组延长11个月，免疫保护期则延至541日龄。从做过2次禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗的3批商品蛋鸡抽检的101份样品结果看，一是禽流感病毒H5、H9亚型抗原检测都是阴性，整个饲养周期未发生过禽流感疫情；二是禽流感病毒H5、H9亚型免疫HI抗体效价平均值尚在6log2至7log2之间，免疫抗体合格率在85%左右；试验结果与调查结果基本一致。商品蛋鸡一个饲养周期一般为一年半，笔者认为，实际工作中只需用禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗，在14～17日龄和96～115日龄时，给商品蛋鸡2次颈部皮下注射，就可有效地预防商品蛋鸡禽流感病毒H5亚型和H9亚型的感染。

3.3 从结果坐标图分析 A、B两组试验鸡禽流感H5亚型和H9亚型HI抗体消长规律，都在疫苗免疫1周后上升，免疫后21～30d达峰值［1-2］。但B组抗体效价峰值比A组抗体效价峰值高出4log2，说明加强免疫后鸡体对禽流感H5亚型和H9亚型病毒的免疫机能比1次性免疫的免疫机能更强大。禽流感H5亚型和H9亚型HI抗体升降幅度基本一致。

3.4 本次禽流感H5亚型和H9亚型HI母源抗体效价平均值的测定 雏鸡12日龄与8日龄相比，时间只相差4d，母源抗体效价平均值从7log2以上迅速下降为4log2以下，说明12日龄后的雏鸡，母源抗体难以抗拒禽流感H5亚型和H9亚型的侵袭。为减少母源抗体对疫苗免疫效果的干扰，我们建议二次性免疫的首免时间为14～17日龄注射疫苗。

［1］蔡戈，亓文宝，徐成刚，等.种鸡禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗免疫程序的研究［J］.中国兽医杂志，2009，45（7）：14-16.

［2］汪淑芳，周春宇，梁梓，等.H5亚型高致病性禽流感免疫抗体检测及分析［J］.畜牧兽医杂志，2008，27（1）：34-27.

［3］吴艳涛，桑莲花，董燕平，等.免疫鸡群新城疫与禽流感的流行病学检测［J］.中国家禽，2009，31（16）：56-57.

［4］GB／T18936-2003.高致病性禽流感诊断技术［S］.