HPLC 法测定人血浆中5-氟尿嘧啶的浓度

叶丽卡，谢志红，陈瑞卿（广州医学院第二附属医院，广州 510260）

5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）是尿嘧啶的类似物，可以使合成脱氧核糖核酸（DNA）的胸腺嘧啶合成酶失活，也可直接替代尿嘧啶掺入核糖核酸（RNA），导致致死合成。因此，在消化道、头颈部肿瘤等多种恶性肿瘤的治疗中，5-FU是最常用的基础药物[1，2]。5-FU在体内代谢半衰期短、毒副反应大，且吸收不规则、个体消除呈非线性，若体内浓度过高时会发生典型的毒副反应如胃肠道毒性和骨髓抑制，还会在生长迅速的正常组织中产生一些毒性作用，包括中枢系统（如小脑变性、共济失调、嗜睡）、心血管系统及皮肤（如手足综合征、感觉迟钝）等毒性作用。因此，有必要建立测定人体血浆5-FU浓度水平的方法用于药动学以及相关研究。众多文献报道用高效液相色谱（HPLC）法成功测定5-FU前体类药物在肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、直肠癌的癌组织、血液、正常组织中不同时间点的浓度变化[3～6]，但方法往往检测限过高或者难以重复。本试验旨在建立一种快速、灵敏、准确的测定人体血浆内5-FU血药浓度的方法，为下一步研究该药在我国人群的药动学打下基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

高效液相色谱系统，包括LC-10ATVP双泵、SPD-M10AVP可变波长紫外检测器、CTO-10AVP柱温箱、SIL-10ADVP自动进样器、CBM-10A系统控制器、DGU-12A脱气装置、LC solution工作站（日本岛津公司）；XW-80涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）；B160A型医用低速离心机（河北白洋离心机厂）；5417R小型台式高速离心机（德国Eppendorf公司）；真空离心浓缩仪（美国Thermo公司）。

1.2 试药

5-FU对照品（美国Sigma公司，批号：097K1352，纯度：99%）；其余试剂均为分析纯；所用超纯水为自制去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate C18色谱柱（250mm×4.5mm，5μm）；流动相：10mmol·L－1KH2PO4溶液；流速：1.0m L·min－1；检测波长：265 nm；柱温：40℃；进样量：20μL。

2.2 对照品溶液配制

准确称取5-FU对照品30.7mg至25m L量瓶，加入1m L盐酸，最后用蒸馏水定容至刻度，得到1.228mg·m L－1的5-FU对照品溶液。

2.3 血浆样品处理方法

取血浆100μL，置于5m L玻璃试管中，加入乙酸乙酯2 m L，涡旋振荡2min后，3 200 r·min－1离心5min，取上层析液置于另一玻璃试管中；再次加入乙酸乙酯2m L进行第2次提取，涡旋振荡2min后，3 200 r·min－1离心5min，取上层析液。合并2次提取的上层析液，离心浓缩挥干，加入100μL流动相，混匀取出，置于EP管中，10 000 r·min－1离心7min，取上清液20μL进样。

2.4 专属性考察

将取空白血浆200μL按“2.3”项下方法操作，取上清液20 μL进样分析，得到空白血浆色谱图，判断空白血浆的干扰情况；取5-FU对照品20μL进样分析，得到5-FU对照品色谱图，判断5-FU在本文方法条件下出峰情况；将空白血浆和5-FU对照品混合，按“2.3”项下方法操作，取上清液20μL进样分析，得血浆+5-FU对照品色谱图。高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.5-FU对照品；B.空白血浆+5-FU对照品；C.空白血浆；1.5-FUFig 1 HPLC chromatogram sA.5-FU control；B.blank plasma+5-FU control；C.blank plasma；1.5-FU

2.5 线性关系考察

取空白血浆8份，分别加入由5-FU对照品和蒸馏水配制的系列标准液适量并混匀，使血浆中药物浓度分别为0.48、0.96、1.92、3.84、7.68、15.35、30.7、61.4μg·m L－1，按“2.3”项下方法处理，最后分别取20μL进样，经HPLC法分析，得到5-FU各浓度峰面积（A）。以峰面积（A）对相应浓度（c）进行回归分析，得到5-FU的回归方程为A＝0.542 2c－0.091 8（r＝0.999 8，n＝8）。结果表明，5-FU血药浓度在0.48～61.4μg·m L－1范围内线性关系良好。

2.6 精密度及回收率试验

配制5-FU低、中、高（1.92、7.68、30.7μg·m L－1）3种不同浓度的含药标准血浆，按“2.3”项下方法处理，每个浓度进行5样本分析，于同日内和连续3 d内分别处理测定。将测得的峰面积代入标准曲线，得相应浓度，计算RSD；与理论浓度相比，求得方法回收率，详见表1。

表1 精密度及方法回收率试验结果（n＝5）Tab 1 Resultsof precision andmethodology recovery tests

2.7 样品稳定性试验

配制含5-FU 1.92、7.68、30.1mg·L－1的3组共15个样品，分别考察室温放置（1、2、3 d）稳定性、长期冻存（－20℃冻存10、20、30 d）以及冻融稳定性（冻融1、2、3次），按“2.3”项下方法分别进行操作及测定，结果其RSD均＜10%。

2.8 样品质量控制试验

分别配制成低、中、高浓度（1.92、7.68、30.1mg·L－1）的血浆样品各12份，置－20℃冻存备用。每次检测血样时同时检测3种质量浓度质控样品，如果相对回收率落在85%～115%之间，即可认为检测正常，否则须检查整个操作过程以及仪器原因。在本试验中，检测的质控样品均在规定范围内，则可认为仪器处于正常状态。

3 讨论

5-FU水溶性很大，在本研究建立的方法中，笔者用纯磷酸盐作为流动相，流动相中不含有机溶剂，容易长菌变质，因此，要注意即时冲洗管道，以免造成污染和堵塞；同时，应注意选用适用于水溶性物质的色谱柱，以免出现色谱柱寿命过短而造成损失和延误试验进程。

因为5-FU为水溶性较强的物质，因此，在部分文献中，采用了蛋白沉淀法处理血浆样品。本研究中笔者发现，若用高氯酸、乙腈、甲醇等沉淀蛋白，在5-FU出峰时间均存在干扰，无法消除或与待测物质分离；另外，蛋白沉淀法往往稀释了药物浓度，而5-FU在血浆中浓度较低，因此，用有机溶剂提取后浓缩更利于提高检测灵敏度。笔者曾尝试用二氯甲烷、异丙醇、氯仿、乙酸乙酯等作为提取溶剂，经比较，乙酸乙酯作为提取溶剂时，提取率最好、干扰少。因此，选用乙酸乙酯作提取溶剂。

经过方法学验证，该方法符合生物样本测定的要求，与文献报道的5-FU测定方法相比，整个试验过程中所用试剂成本低，适合大样本研究中血浆中5-FU浓度的测定。该方法具有操作简便可靠、准确、稳定性高等特点，适用于人血浆中5-FU的浓度测定。该方法的建立可以为5-FU的人体药动学相关研究提供参考。

[1]黎远冬，梁宁生，韦劲松，等.HPLC法同时测定人血浆中5-氟尿嘧啶及其活性代谢物5-氟-2脱氧尿嘧啶核苷的浓度[J].药物分析杂志，2007，27（4）：494.

[2]刘传华，刘师莲，卞继峰，等.HPLC快速测定5-氟尿嘧啶血药浓度[J].药物分析杂志，2002，22（2）：96.

[3]陆基宗，温 浩，许英华，等.肝癌患者5-氟尿嘧啶血药浓度的监测与测定方法的改进[J].中国医院药学杂志，2004，24（2）：83.

[4]姚水宝，杨水新.高效液相色谱法测定人血清中5-氟尿嘧啶的浓度[J].中国药房，2001，12（4）：227.

[5]Licea-Perez H，Wang S，Bowen C.Developmentof a sensitive and selective LC-MS/MSmethod for the determination of alpha-fluoro-beta-alanine，5-fluorouracil and capecitabine in human plasma[J].JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2009，877（11）：1 040.

[6]Kosovec JE，Egorin MJ，Gjurich S，et al.Quantitation of 5-fluorouracil（5-FU）in human plasma by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2008，22（2）：224.