慢性肝病患者肝螺杆菌血清抗体水平分析

李红艳 张永贵 王 静 季尚玮 斯庆图娜拉 王江滨 (吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 130033)

1992年，美国国立癌症研究所的病理学家在患有肝细胞癌的A/JCr小鼠的体内分离出一种新型螺杆菌，命名为肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus，H.hepaticus)〔1〕。研究发现，健康小鼠腹腔注射肝螺杆菌后，可出现慢性活动性肝炎，并在肝细胞外间隙及肝内胆道系统内发现菌体，因此肝螺杆菌可能成为这种成年小鼠发生慢性肝炎及伴随肝细胞癌的病因学因素。关于螺杆菌属在人类肝脏疾病中可能起的作用知之甚少，但是在胆汁中通过 PCR检测到 H.pylori的 DNA。Fox等〔2〕研究发现H.hepaticus，H.bilis以及其他肠肝螺杆菌可能在慢性胆囊炎和慢性肝病的发病中起作用。本研究比较不同人群血清中抗H.hepaticus－IgG抗体和抗 H.pylori－IgG抗体反应，同时分析两种螺杆菌抗原之间的交叉反应，为进一步了解H.hepaticus在慢性肝病中可能起的协同作用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 病例资料 (1)病例组为吉林大学中日联谊医院消化内科2007年10月至2009年6月期间不同肝病患者76名〔男50例，女26例，平均年龄(40.7±15.8)岁〕;诊断基于病史、生化学、免疫学和肝组织学检查。血清酶学升高和/或临床症状持续超过6个月可诊断为慢性疾病，其中慢性病毒性肝病患者52例(慢性乙型病毒性肝病27例、慢性丙型病毒性肝病25例)，自身免疫性肝炎8例和慢性酒精性肝病16例，患者合并有肝硬化25例。(2)正常体检人群:作为成年人代表性样本，随机选自吉林大学中日联谊医院体检中心80例，正常体检人群〔男44例，女36例，平均年龄(43.8±16.4)岁〕。(3)健康献血者:80例随机选自长春市中心血站，男42例，女性38例，平均年龄(35.6±10.6)岁。所有标本均检测HBV和HCV阴性。所有标本保存在－20℃。

1.2 H.hepaticus、H.pylori标准菌株及培养 H.hepaticus标准菌株ATCC51450购自美国国家标准菌种保藏中心(ATCC)，H.pylori标准菌株SS1由中国疾病控制中心诊断室提供。H.hepaticus、H.pylori冻存菌株经布氏琼脂培养基复苏，于微需氧(5%O2，10%CO2，85%N2)、37℃、高湿度条件下分别培养7～10 d、3～4 d，可疑菌落经鉴定为 H.hepaticus及 H.pylori后进行纯培养2～3代，备用。

1.3 H.hepaticus、H.pylori抗原制备 分别选取稳定传代的H.hepaticus标准菌株ATCC51450及H.pylori标准菌株SS1，用无菌生理盐水洗脱固体平板上的细菌，4℃、3000 r/min离心10 min后弃上清，重新加入生理盐水并用毛细细管吹打，悬浮后再离心，收集细菌。然后用小体积无菌生理盐水悬浮，冰浴超声粉碎10 min，4℃、12000 r/min离心20 min，收集上清。细菌残渣再超声粉碎10 min，重复上述过程一次。合并两次上清，测蛋白浓度，分装后置－80℃保存，备用。

抗原浓度计算:超声粉碎细菌抗原稀释后，用U－341紫外可见分光光度计测260 nm和280 nm波长的吸光度值(A260、A280)，按下列公式计算浓度:

蛋白浓度(mg/ml)=(1.74×A280－0.75×A260)×稀释倍数。

1.4 抗H.hepaticus、H.pylori多克隆抗体的制备 2 ml弗氏佐剂(首次免疫时应用弗氏完全佐剂，以后应用弗氏不完全佐剂)加热后，放入无菌研钵内，冷却后缓慢分别滴入已获得的H.hepaticus、H.pylori超声粉碎抗原(200 μg/ml)2 ml，研磨至乳白色黏稠的油包水乳剂。免疫方法采用背部多点注射法，即在家兔脊柱两旁选6点皮下注射，每点注射0.2 ml，间隔10 d后再于上述部位选不同点注射。每次免疫的抗原量约100 μg。每次免疫1 w后，耳缘静脉取血检测抗体效价。当效价在1∶16以上时心脏采血分离血清制备抗H.hepaticus及抗H.pylori抗体。

1.5 血清抗 H.hepaticus－IgG抗体、抗 H.pylori－IgG抗体检测

应用H.hepaticus、H.pylori超声粉碎抗原包被ELISA反应板。将1∶100稀释的待测血清100 μl加入H.hepaticus抗原包被的ELISA反应孔中，H.hepaticus、H.pylori抗原免疫兔子获得的多克隆抗体作为阳性对照，H.hepaticus、H.pylori抗原免疫兔子前的血清作为阴性对照，PBS作为空白对照，封盖后37℃孵育1 h。用漂洗液漂洗3次。每孔加入辣根过氧化物酶标记二抗(待测血清中加羊抗人二抗，阳性对照、阴性对照和空白对照中加羊抗兔二抗)(辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠及抗兔二抗由华特生生物技术有限公司提供)稀释液(1∶500)100 μl，封盖后37℃孵育1 h。漂洗3次后每孔加入显色液100 μl，37℃避光显色20 min，加入0.2 N的硫酸终止显色。在酶标仪上读取450 nm的光密度(OD)值。ELISA结果用相对抗体活性(relative antibody activity RAA)表示，RAA是参照标准(丙种球蛋白，山西康宝生物制品股份有限公司)的百分数作为吸光率值的修正均值。比较三组每种螺杆菌的RAA均值。

1.6 吸收试验 为了吸收可能的抗体交叉反应，超声处理H.pylori整个细胞，收集 H.pylori细胞用PBS(pH7.2)洗涤1次，冰内超声处理8次，每次60 s，每次间隔30 s，平均输出功率45 W。将1 ml超声处理的细胞加入到PBS中，加入10 μl血清，在22℃孵育1 h，然后在6°C不停摇匀16 h。12000 r/min离心10 min移去细胞，收集上清液用于血清学检查。作为对照，H.pylori抗体完全吸收，被吸收后的血清再次做ELISA，三组人群中H.pylori平均RAA值均低于吸收试验前的水平。

2 结果

2.1 吸收试验前后三组人群抗H.hepaticus－IgG和抗H.pylori－IgG抗体的相对抗体活性分析 吸收实验前CLD患者抗H.hepaticus－IgG抗体RAA平均值明显高于献血者组和普通体检人群组(P＜0.001);CLD患者和普通体检人群抗H.pylori－IgG抗体的RAA平均值明显高于献血者(P＜0.001)。CLD组抗H.hepaticus－IgG抗体的RAA平均值在吸收试验前后差异无显著性变化(P＞0.05);普通体检人群和献血者抗H.hepaticus－IgG抗体的RAA平均值在吸收试验后有所增高，但无显著性差异(P＞0.05)。见表1。

表1 吸收试验前后三组人群抗H.hepaticus和H.pylori抗体的相对抗体活性(±s)

表1 吸收试验前后三组人群抗H.hepaticus和H.pylori抗体的相对抗体活性(±s)

与CLD组比较:1)P＜0.001;与献血组比较:2)P＜0.001

H.pylori CLD组 76 40.85±16.92 35.79±16.8041.23±18.502)组别 n 吸收实验前 吸收实验后体检人群组 80 25.52±7.87 30.46±11.2242.10±11.342)献血者组 80 17.93±7.321)18.22±7.11 27.26±8.03

2.2 CLD患者中不同肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗体的相对抗体活性分析 CLD患者中除自身免疫性肝炎患者外，慢性乙型肝炎患者、慢性丙型肝炎及酒精性肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗体的RAA均明显增高，慢性丙型肝炎患者抗H.hepaticus－IgG抗体的RAA值明显高于其他肝病患者(P＜0.001)，吸收试验前后抗H.hepaticus－IgG抗体的RAA值无显著性变化(P＞0.05)。见表2。

表2 CLD患者中不同肝病患者抗H.hepaticus抗体的相对抗体活性(RAA，±s)

表2 CLD患者中不同肝病患者抗H.hepaticus抗体的相对抗体活性(RAA，±s)

与丙肝患者比较:1)P＜0.001

组别 吸收试验前 吸收试验后乙肝患者(n=27) 34.70±12.021) 28.55±12.631)丙肝患者(n=25) 57.68±13.27 50.72±16.07自身免疫性肝炎(n=8) 17.83±4.241) 17.77±3.231)酒精性肝病(n=16) 32.97±8.261) 31.65±8.181)

3 讨论

H.hepaticus自发现并分离至今，国内外研究显示在世界范围内不同品系实验室小鼠中均不同程度存在H.hepaticus感染〔3〕。H.hepaticus主要定植于小鼠的下胃肠道及肝脏，除A/JCr小鼠外，还能诱发 C3H/HeNCr、BALB/cAnNCr、SCID/NCr等多种品系的小鼠发生肠道炎症及慢性活动性肝炎，甚至并发肝癌〔1，4〕。螺杆菌菌属是一组革兰阴性、微需氧螺旋弯曲状细菌，最初从人类及其他哺乳动物的胃组织中分离出来的〔5〕，研究显示这类细菌可能与人或动物的胃肠道、肝胆系统和一些恶性肿瘤的发生相关〔6，7〕。因此进一步研究这些新型螺杆菌在人类肝病中可能的作用具有重要意义。

本研究三组人群中慢性肝病患者吸收试验后H.hepaticus抗体反应仍保持较高水平，同时慢性肝病患者中除自身免疫性肝炎患者外，慢性乙型肝炎患者、慢性丙型肝炎及酒精性肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗体的相对抗体活性均明显增高，慢性丙型肝炎患者抗H.hepaticus－IgG抗体的相对抗体活性明显高于其他肝病患者，表明这种螺杆菌抗原或其他未被鉴定的螺杆菌的抗体反应具有特异性，这种微生物有可能参与了慢性肝病的发病机制。在普通人群和献血者吸收试验后H.hepaticus的抗体反应反而有所增加，这一发现目前还无法解释。

Roe等〔8〕在各种胆管疾病患者的胆汁中检测螺杆菌DNA，应用螺杆菌属特异性PCR在原发硬化性胆管炎和原发胆汁性肝硬化患者肝组织中检测到螺杆菌包括H.pylori。在近50%患者胆汁和肝脏标本螺杆菌DNA阳性。在另一研究中〔9〕，胆管癌、肝细胞癌患者应用螺杆菌属特异性引物检测71%和75%肝脏标本螺杆菌属PCR阳性。最近，一种与H.pylori相似的菌株从肝豆状核变性肝硬化女性患者的肝脏中分离出来，证实螺杆菌可以感染人类肝脏。

总之，在本研究中发现H.hepaticus和H.pylori的细胞表面蛋白具有较高的交叉反应，提示菌属特异性具有免疫原性蛋白用于酶免疫测定时需要鉴定和纯化。慢性肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗体的相对抗体活性在吸收试验后仍保持较高水平，这些发现提示在慢性肝病患者体内存在H.hepaticus的感染，但其在人类肝病发生发展中可能的协同致病作用还需要进一步研究探讨。

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2 Fox JG，Dewhirst FE，Shen Z，et al.Hepatic Helicobacter species identified in bile gallbladder tissue from Chileans with chronic cholecystitis〔J〕.Gastroenterology，1998;114:755－63.

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7 Myles MH，Livingston RS，Franklin CL.Pathogenicity of Helicobacter rodentium in A/JCr and SCID mice〔J〕.Comp Med，2004;54(5):549－57.

8 Roe IH，Kim JT，Lee HS，et al.Detection of helicobacter DNA in bile from bile duct diseases〔J〕.J Korean Med Sci，1999;14:182－6.

9 Nilsson H，Mulchandani OR，Tranberg KG，et al.Helicobacter species identified in liver from patients with cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma〔J〕.Gastroenterology，2001;120:323－4.