神经调节素对痴呆大鼠模型海马区TNF－α表达的影响

王利华 张 睿 田 强 陈 燕 张美增 (青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 26602)

近年来随着人口老龄化的进展，人的寿命逐渐增加。与此同时，阿尔茨海默病(AD)的发病率也逐年增加。AD是一种进行性神经退行性疾病，以近期记忆障碍为主要临床症状，其特征性病理变化是老年斑、神经原纤维缠结。有研究证实，大脑海马区神经元凋亡和炎症反应可能是AD的发病机制之一〔1〕，目前尚无有效的治疗措施。动物实验研究表明，神经调节素－1β(NRG－1β)能抑制脑缺血诱导的炎症反应和细胞凋亡，具有一定的神经保护作用〔2，3〕。本实验试图利用单侧侧脑室注射β淀粉样蛋白1～40(Aβ1～40)的方法建立拟痴呆大鼠模型，从细胞凋亡和炎症反应角度探讨NRG－1β治疗AD的机制。

1 材料与方法

1.1 动物来源 健康成年雄性Wistar大鼠40只，体重200～220 g，由青岛市药检所实验动物中心提供〔SCXK(鲁)20070010〕。实验前，将动物置于实验室适应环境1 w，自由进食、饮水;室温(23±2)℃，自然光照。

1.2 学习记忆能力训练〔4〕应用Ⅰ－Ⅱ－Ⅲ三等臂式Y型电迷宫作为刺激器。首先将大鼠放入迷宫的Ⅰ臂，适应3 min后进行刺激(电压60 V，电流0.5～0.7 mA，持续2 s)。其余两臂中的任一臂灯光亮信号示为安全区。如果大鼠进入安全区为正确反应，否则为错误反应。第2步训练以此安全区作为起步区，并使大鼠在安全区停留1 min巩固记忆，再次给予电刺激，以此类推，按方向(Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ)依次改变安全区位置。学习测试:按上述方法每天固时间定训练10次，连续7 d，以测试达到连续10次中有9次(9/10)正确反应前所需的电击次数，即尝试次数表示学习能力。淘汰反应过于迟钝大鼠。记忆再现测试:学习测试完成24 h后以同样方法进行，以达到9/10标准。正确反应次数定为A，以A/10表示记忆的保持的能力，此值越高说明记忆力越好。

1.3 动物模型制备〔5，6〕将 Aβ1～40(Sigma公司)用 0.1 mol/L PBS稀释成2 g/L，37℃孵育72 h，变为聚集状态。从上述40只大鼠中筛选具有学习和记忆能力的30只，随机分为对照组、模型组和治疗组各10只。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg体重)，固定于脑立体定位仪(江湾ⅠC)，颅顶正中线切开皮肤，用骨钻钻孔，以微量注射器垂直进针，向左侧脑室(定位坐标AP=0.8 mm，ML=1.1 mm，DV=3.6 mm)缓慢注入凝聚态 Aβ1～405 μl，1 μl/min，5 min 内注射完毕，留针 5 min，以保证Aβ1～40充分弥散，缓慢退针，牙科水泥封固，缝合切口。对照组同步注射等体积0.1 mol/L PBS。

1.4 干预措施 将基因重组NRG－1β(R＆ D Systems，Inc)应用0.1 mol/L PBS溶解稀释成1 g/L的溶液。造模成功后7 d，用Y型电迷宫测试动物的学习记忆能力。然后，治疗组按照5 μg/kg剂量，经右侧侧脑室注射 NRG－1β 5 μl。对照组和模型组同步注射等体积0.1 mol/L PBS。对照组、模型组及治疗组最终入组动物分别为8、7、7只。

1.5 评价指标

1.5.1 记忆再现测试 治疗后7 d，用Y型电迷宫测定大鼠的学习记忆功能。

1.5.2 标本采集 行为测试后，10%水合氯醛麻醉动物，4%多聚甲醛溶液经心脏灌注固定，断头完整取脑，常规乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。自视交叉后方连续冠状位切片(厚5 μm)，贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上，4℃保存备用。

1.5.3 细胞凋亡 切片常规脱蜡水化，按照TUNEL凋亡检测试剂盒(武汉博士德生物工程公司)操作，光镜下观察，胞核有棕色颗粒者为阳性细胞。部分切片不加探针，用0.1 mol/L PBS代替，不出现阳性反应。每只大鼠取4张连续切片，每张切片计数4个高倍视野中的阳性细胞数，取其均值。

1.5.4 免疫组化 兔抗鼠TNF－α抗体、SABC试剂盒、DAB染液购于武汉博士德生物工程公司。按试剂盒说明书操作，DAB显色，光镜下胞浆有棕色颗粒者为阳性细胞。部分切片不加一抗，用0.1 mol/L PBS代替，不出现阳性反应。每只大鼠取4张切片，高倍镜下海马区随机取4个视野，LEICA Qwin图像处理系统分析各视野吸光度值(A)，减去背景A值，取其相对值(⊿A)。

2 结果

2.1 大鼠学习记忆能力 模型成功后大鼠尝试次数较造模前显著性增多(P＜0.05)，即出现学习和记忆能力下降;但对照组前后无显著性差异(P＞0.05)。NRG－1β治疗7 d后，治疗组动物尝试次数较模型组显著少(P＜0.05)，提示治疗组学习和记忆成绩优于模型组，但尝试次数仍显著高于对照组(P＜0.05)。

2.2 细胞凋亡 对照组、模型组和治疗组动物海马区均可见数量不等的凋亡神经细胞，其中模型组和治疗组凋亡细胞数量均显著显著高于对照组(P＜0.05)，治疗组显著低于模型组(P＜0.05)、但仍高于对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠海马区细胞凋亡和TNF-α表达(±s)

表1 各组大鼠海马区细胞凋亡和TNF-α表达(±s)

与对照组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

组别 n 细胞凋亡 TNF－α(⊿A)5.3±2.12 0.18±0.06模型组 7 22.4±4.371) 0.46±0.121)治疗组 7 13.6±3.621)2) 0.31±0.181)2)对照组8

2.3 TNF－α表达 TNF－α表达相对吸光度值(⊿A)在各组大鼠之间有显著性差异(P＜0.05)。组间比较显示，模型组TNF－α表达⊿A值显著高于对照组(P＜0.05)，治疗组⊿A值显著低于模型组(P＜0.05)、但仍高于对照组(P＜0.05)。见表1。

3 讨论

近年有研究表明〔7〕，Aβ是炎性反应的启动因素，Aβ可激活胶质细胞，产生炎症介质，引起神经毒作用。Bamberger等〔8〕发现，小胶质细胞膜上的受体复合物与沉积在神经元周围的Aβ相互作用，使小胶质细胞活化、增殖，并过量分泌促炎因子，介导炎症损伤。炎性因子通过Toll样受体4和核转录因子κB(TLR4－NFκB)信号传导途径引起 NF－κB 激活，促进诸如 TNF－α等靶基因激活，最终诱导神经细胞凋亡〔9〕。星型胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞被缺血激活后产生炎性因子，与细胞膜受体TLR4结合，引起一系列氧化磷酸化过程，激活细胞内NF－κB表达，活化的NF－κB进入细胞核促进TNF－α等炎性因子的mRNA转录，继而上调其他相关炎性因子的表达，进一步加重炎症反应，损伤神经细胞〔10〕。Li等〔2，3〕研究表明，NRG－1β 能抑制脑缺血诱导的信号转换和转录激活因子3(STAT3)炎症反应和凋亡，缩小脑梗死体积，改善动物的行为功能，提示NRG－1β能有效地抑制炎症反应而发挥神经保护作用。?

1 Shimohama S.Apoptosis in Alzheimer′s disease－an update〔 J〕.Apoptosis，2000;5(1):9－16.

2 Li Q，Li Z，Mei YW，et al.Neuregulin attenuated cerebral ischemia－reperfusion injury via inhibiting apoptosis and upregulating aquaporin－4〔J〕.Neurosci Lett，2008;443(3):155－9.

3 李 琴，秦丽华，栾丽菊，等.神经调节素对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡和STAT3和GFAP表达的影响〔J〕.解剖学报，2008;39(6):820－5.

4 王跃春.Y型电迷宫在大鼠学习记忆功能测试中的合理运用〔J〕.中国行为医学科学杂志，2005;14(1):69－70.

5 Nabeshima T.Trial to produce animal model of Alzheimer′s disease by continuous infusion of beta－amyloid protein into the rat cerebral ventricle〔J〕.Nihon Shinkei Seishin Yakurigaku Zasshi，1995;15(5):411－8.

6 楚 晋，李 林.脑室灌注β－淀粉样肽致痴呆动物模型〔J〕.中国药理学通报，2004;20(7):827－36.

7 王子红，文 彬，潘国际，等.治疗阿尔茨海默病药物的研究进展〔J〕. 中国临床康复，2002;6(19):2938－9.

8 Bamberger ME，Harris ME，Mc Donald DR，et al.A cell surface receptor complex for fibrillar beta－amyloid mediates microglial activation〔J〕.J Neurosci，2003;23(7):2665－74.

9 Bi X，Yan B，Fang S.Quetiapine regulates neurogenesis in ischemic mice by inhibiting NF－kappaB p65/p50 expression〔J〕.Neurol Res，2009;31(2):159－66.

10 Boersma MC，Meffert MK.Novel roles for the NF－κB signaling pathway in regulating neuronal function〔J〕.Sci Signal，2008;1(6):pe7.