生脉六味地黄汤加减方对大鼠小肠内表面黏膜α-糖苷酶的抑制作用

邢 磊 焦颖华 耿丽华 孙 尧 (河北联合大学附属医院老年病科，河北 唐山 063000)

寻找有效治疗2型糖尿病的药物已成为国际医药学界的一个研究热点。胰岛素疗效肯定，肝肾损害小，但易出现低血糖。磺脲类、双胍类、噻唑烷二酮类及α-葡萄糖苷酶抑制剂疗效肯定，但有原发失效、继发失效及心血管、消化道的副作用。为了克服上述药物的缺点，我们从传统中药复方入手，通过中药复方的多脏腑同治、整体调节的优势，达到有效控制糖尿病的目的。糖尿病中医辨证多为气阴两虚证型，生脉六味地黄汤加减方益气养阴，补脾益肾，控制心烦口干、神疲乏力等症。该方控制血糖的作用是否类似于α-糖苷酶抑制剂，通过α-糖苷酶抑制实验予以证实。α-糖苷酶存在于小肠绒毛黏膜细胞刷状缘上，具有水解α-1，4糖苷键，将多糖水解为葡萄糖的作用〔1〕。α-糖苷酶抑制剂是通过抑制α-糖苷酶的活性，从而延缓肠道葡萄糖的吸收，达到控制餐后血糖的目的。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性 Wistar大鼠，体重(220±10)g，由北京中国医学科学院实验动物研究所提供。

1.2 药品及试剂 生脉六味地黄汤加减方:炒黄芪20 g、人参10 g、麦冬 6 g、五味子 5 g、生地黄 25 g、山茱萸 12 g、山药12 g、泽泻10 g、茯苓10 g、丹皮10 g(均购自安国药都集团茗都饮片厂);阿卡波糖(Acarbose)(杭州中美华东制药有限公司，批号:080401);麦芽糖(分析纯，汕头市光华化学厂，批号101210);血糖试剂盒(上海科华东菱诊断用品有限公司，批号:20101121)。

1.3 仪器 X-22R低温离心机(德国BECKMAN公司)、酶标仪(BIO-RAD)、sartorius电子分析天平、EP管、冰板、96孔板、微量移液器及配套枪头、烧杯、一次性塑料试管。

1.4 方法及步骤

1.4.1 提取小肠 α-糖苷酶〔2〕雄性 Wistar大鼠1只，禁食24 h，脱臼处死，取约20 cm长的小肠，挤出内容物，剪开后，于冰板上刮取内表面黏膜，加入2倍量4℃的PBS液，用匀浆器匀浆后于4℃，5 000 r/min离心20 min，取上清液即α-葡萄糖苷酶液，－20℃保存备用。

1.4.2 测定酶活力和确定最佳反应体系

1.4.2.1 测定酶活力〔3〕确定反应体积为1 000 μl，取酶液50 μl，加 400 μl PBS 液，37℃ 恒 温 箱反 应 10 min，加 入0.25 mol/L的麦芽糖溶液50 μl，反应30 min后加入0.1 mol/L的Na2CO3溶液500 μl终止反应。氧化酶法测定葡萄糖含量。酶活力单位定义:在37℃，pH6.8的条件下，每分钟水解底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量，规定为一个酶活力单位。

1.4.2.2 确定最佳反应体系

1.4.2.2.1 酶浓度的确定 取50 μl麦芽糖溶液，加入2，4，8倍稀释的酶液50 μl，37℃反应20 min，在490 nm波长下测定吸光度值，根据葡萄糖的生成量计算α-糖苷酶的活性。

1.4.2.2.2 确定反应底物 在1 000 μl反应体系中，分别加入终浓度为0.125，0.25，0.5 mmol/l的麦芽糖，于37℃恒温箱反应10，20，30 min后，在490 nm波长下测定吸光度值，计算葡萄糖生成量，以葡萄糖的生成量计算α-糖苷酶活性。

1.4.2.3 生脉六味地黄汤加减方对α-糖苷酶的影响

1.4.2.3.1 生脉六味地黄汤加减方的制备〔2〕称取60 g生脉六味地黄汤加减方饮片，加600 ml纯净水，浸泡30 min，煎煮20 min，取上清液浓缩为60 ml，即得1 g/ml的溶液。将所得溶液用纯净水稀释成 0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000 mg/ml不同浓度的溶液。不同浓度的溶液各取10 ml，加入活性炭0.02 g〔4〕，脱色 15 min，离心取上清，即得脱色液。阿卡波糖100 mg(2片)溶于10 ml纯净水中，混匀后稀释成0.001、0.01、0.1、1、10 mg/ml不同浓度的溶液。上述溶液均于－20℃保存备用。

1.4.2.3.2 生脉六味地黄汤加减方对α-糖苷酶的影响 ①上述每种溶液各取100 μl，加PBS液300 μl，再加入4倍稀释的酶液50 μl;②对照管加 PBS 液 400 μl，再加 4 倍稀释的酶液50 μl;③空白组只加 PBS 液 50 μl，37℃ 恒温箱反应 10 min;④除空白组不加麦芽糖溶液外，其余各管均加入0.25 mol/L麦芽糖溶液50 μl，37℃恒温箱反应 20 min后;⑤加入0.1 mol/L Na2CO3溶液500 μl终止反应，空白组不加Na2CO3溶液;⑥各反应液各取20 μl放入96孔板孔中，再加1∶1稀释的酚酶试剂20 μl，每个浓度3个复孔，37℃恒温箱反应 10 min;⑦酶标仪490 nm波长下测定反应液的吸光度值A。

2 结果

2.1 确定的最佳反应体系 取待测溶液1 000 μl，加PBS液300 μl，再加入 4 倍稀释的酶液 50 μl，37℃恒温箱反应 10 min，加入0.25 mol/l的麦芽糖溶液50 μl，37℃反应20 min后，加入Na2CO3液500 μl终止反应，此为最适合反应体系。

2.2 生脉六味地黄汤加减方对α-糖苷酶的影响 生脉六味地黄汤加减方对α-糖苷酶影响的实验结果表明:生脉六味地黄汤加减方对α-糖苷酶有明显的抑制作用，且最高抑制率大于50%。但因该中药高溶液颜色较深，影响吸光度值，进而使计算出的抑制率下降，故用活性炭脱色。脱色后高浓度药物，如100 mg/ml溶液抑制率升高，但同时低浓度溶液的抑制率明显较脱色前降低，说明活性炭脱色时，也将部分药物有效成分脱掉了，结果见表1。

阿卡波糖组在实验中表现出良好的浓度效应关系:随药物浓度的增加，其抑制作用逐渐增强。生脉六味地黄汤加减方在10 mg/ml浓度范围以下具有良好的浓度效应关系，在该浓度之上因颜色及其他因素影响抑制率迅速下降。结果见表1。

表1 生脉六味地黄汤加减方及脱色后复方对α－糖苷酶抑制率及与阿卡波糖的比较(%，n=3)

3 讨论

糖尿病属中医的消渴病病症范畴。在消渴病的常见发病类型中，以气阴两虚最为多见。其症状可见神疲乏力，面色不华，心烦口干，精神不集中，失眠，舌红少苔，脉细弱。针对该类型我们从益气养阴入手，以生脉六味地黄汤加减方治疗该症型。生脉散出自《内外伤辩惑论》:益气养阴，复脉固脱，该方主治气阴两伤所致的体倦气短、脉细弱。六味地黄丸能滋阴补肾，用于治疗头晕耳鸣，失眠，心烦口干，腰膝酸软等肾阴亏耗症。另加大剂量炒黄芪益气健脾，纠正倦怠乏力、食欲不振等症状。生脉散和六味地黄丸两方合用可达到益气养阴，滋补肾阴的作用;再加上大剂量黄芪，益气健脾;全方共奏脾肾同治，益气养阴之功。现代药理研究表明:该方中的山茱萸、五味子〔1〕、黄芪、人参、山药〔5〕、生地黄〔2〕有类似 α-糖苷酶抑制剂的作用，麦冬和泽泻也具有明显地降血糖作用。

α-糖苷酶抑制剂延缓复杂碳水化合物和双糖的分解和消化，降低餐后血糖的作用机制明确，疗效确切。该类药物包括阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等，而阿卡波糖临床应用较广泛，故本次实验选用阿卡波糖作为阳性对照组。

α-糖苷酶实验所用酶主要有大鼠小肠提取酶和人工合成酶两种，有研究表明用两种酶做出的实验结果基本相同，而大鼠小肠酶的成本较低，故本次实验应用新鲜提取的Wistar大鼠小肠酶做实验，检测药物的糖苷酶抑制作用。

本实验通过药物作用后的吸光度值计算抑制率，吸光度值测定时受颜色影响较大，颜色越深，吸光度值越大。生脉六味地黄汤加减方溶液颜色较深，影响吸光度，为减少药物颜色的影响因素，我们采用活性炭脱色法祛除部分颜色，观测抑制率的变化情况。实验结果表明高浓度溶液颜色较深，抑制率明显下降，而应用活性炭脱色后，颜色变浅，抑制率有所上升;在较低浓度溶液中脱色后α-糖苷酶抑制率相应降低。本实验表明活性炭能明显改善高浓度溶液因严重颜色影响计算出的抑制率，但同时也将部分有效成分脱掉了，在一定比例上降低了原有药物的实际抑制率。是否能找到既能排除颜色影响，又能更好地测定出药物的实际抑制作用的方法，将成为我们下一步的实验研究目标。

1 寇 彤，孟晓敏，常建涛，等.何首乌对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用〔J〕.大连轻工业学院学报，2006;25(4):239-41.

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3 张海凤，董亚琳，胡萨萨，等.五种中药对两种不同来源α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用比较〔J〕.中药材，2008;31(7):1024-7.

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5 吴酬飞，许 样，李燕萍.α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型的研究进展〔J〕.国际药学研究杂志，2008;35(1):9-11.