人工种植和野生三叶青中总黄酮含量的比较

吉庆勇，华金渭，程文亮，朱 波，王喜周，李美美

(1.浙江省丽水市农业科学研究院，浙江丽水 323000;2.丽水学院医学院，浙江 丽水 323000;3.浙江省医学科学院，浙江 杭州 323000)

三叶青(Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg)为葡萄科植物三叶崖爬藤地下块茎，属于我国特有植物，分布在浙江、江西、云南等省份。其性凉，味辛、无毒，常用于治疗高热惊厥，小儿感冒发烧、肝炎、支气管炎及支气管哮喘等症，对一些病毒性疾病，慢性和迁延性疾病有很好的功效［1－2］。三叶青中的化学成份主要有黄酮、黄酮苷、淀粉、还原糖、甾类化合物、氨基酸等［3］，其中黄酮是重要的生理活性物质，具有很好的抗肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡等作用［4－5］。

随着对三叶青药用价值的深入研究，市场需求量必然进一步增加，而野生资源由于过度采挖，已濒临灭绝状态。因此，既要保护数量极少的野生三叶青资源，又要满足市场需要，促进其可持续发展，开展三叶青的人工种植十分必要。丽水市农科院近年来开展三叶青引种栽培和野生驯化，已人工种植20余亩。本文采用紫外可见分光光度法测定丽水地区不同区域野生和人工种植三叶青中的黄酮含量，并对结果进行了分析［6］，以期为今后大面积的三叶青人工种植提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

UV-120-02型紫外-可见分光光度计(日本岛津);BP-II-5分析天平(上海医用激光仪器厂生产)，SHZ-C型水循环式多用真空泵(巩义市英峪予华仪器厂);202A-2电热干燥箱(上海阳光试验仪器有限公司)等。芦丁标准品(中国药品生物制品检定所，批号 100080-200306)，乙醇、NaNO2，Al(NO3)3，KOH均为分析纯。

1.2 试验材料

于2011年3月至4月，从丽水松阳县、丽水莲都区、丽水景宁县、丽水青田县、丽水农科院栽培基地实地采集三叶青样品，全部为鲜品(编号为:S1-人工、S2-人工、S3-人工，均为农科院三叶青种植基地5年生样品，野生样品编号为S4-松阳、S5-景宁、S6-莲都、S7-青田)。

1.3 方法

1.3.1 测定波长的选择

取对照品和供试品分别置25 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以紫外可见分光光度法测定在200～700 nm区间扫描吸收曲线。供试品溶液在500 nm处有最大吸收，与芦丁对照溶液吸收曲线相似，故选用500 nm为测定波长［7］。

1.3.2 对照品溶液的制备

精密称取芦丁对照品2.80 mg置于50 mL，加70%乙醇溶解，定容至刻度，摇匀，得浓度为0.056 mg·mL－1的芦丁对照品溶液。

1.3.3 标准曲线的绘制

精密吸取 0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3 mL芦丁对照溶液，分布置于10 mL容量瓶中，方法同1.3.1，测定吸光值，得标准曲线为 C=9.137×10－2A －4.524 ×10－3，其线性范围为 8.02 ～39.35 mg，r2=0.998 9。

1.3.4 供试品溶液的制备与含量测定

取本品粉碎，过60目(0.25 mm)筛，精密称取0.50 g，置圆底烧瓶中，加乙醇50 mL，加热回流提取2次，每次1 h，取出冷却，过滤，滤液挥发干，残渣用适量乙醇溶液转移到10 mL容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀即得。精密量取0.5 mL，分别置10 mL量瓶中，按1.3.1中方法测定吸光度，试验重复3次。

1.3.5 重现性试验

精确称取三叶青样品3.0 g，处理后在500 nm处测定吸光度，重复5次，回归方程法计算平均总黄酮的质量浓度，其RSD为1.67%。该试验方法重现性较好。

1.3.6 稳定性试验

精密称取0.4 mL供试品溶液于10 mL刻度试管中，加5%亚硝酸盐溶液1.0 mL，摇匀放置5～6 min;加1.5 mol·L－1氢氧化钠溶液 5.0 mL，加70%乙醇至满刻度，摇匀放置10 min;取2.0～3.0 mL显色液于比色皿中在500 nm之间扫描测定吸光度，每隔0.5 h测定1次，共测定7次，样品提取液3 h稳定性较好。

1.3.7 精密度试验

精密称取芦丁标准溶液1 mL，同“标准曲线的绘制”操作，连续测量6次，测定吸光度值，RSD为2.12%。

1.3.8 加样回收率试验

精密吸取芦丁对照溶液1.0，1.5，2.0 mL各3份，分别加入供试品溶液3 mL，处理后在500 nm处测定吸光度，计算总黄酮含量，得其平均回收率为99.76%，RSD为2.61%。

2 结果与分析

人工种植与野生三叶青总黄酮的含量比较见表1。人工种植三叶青总黄酮含量最高为S2基地，含量达 11.226 8 mg·g－1，平均为 10.194 3 mg·g－1。野生样品平均总黄酮含量为10.160 1 mg·g－1，其中丽水松阳样品含量最高，达到10.925 9 mg·g－1，丽水莲都最低，仅为 9.162 5 mg·g－1。研究结果表明，人工种植三叶青总黄酮含量与野生三叶青无显著差异(P＞0.05)。从黄酮含量看，人工种植三叶青可以替代野生三叶青，弥补三叶青野生资源的不足，为开发三叶青中药产品提供优质原料。

表1 人工种植与野生三叶青中总黄酮的含量(n=3)

3 小结和讨论

三叶青作为一种珍稀的中药，化学成分复杂，其开发利用尚处起步阶段，其中所含主要化学成分黄酮具有显著的生物学活性，具有很好的抗菌、抗病毒、抗肿瘤的特点。对野生与人工种植产品总黄酮含量的分析、比较，科学评价人工种植三叶青的质量，对控制三叶青药材质量，深入开展三叶青的种植驯化研究及资源利用有重要意义，为开发利用三叶青资源和确保人工种植的品质提供了科学的依据。

［1］杨学楼，罗经，孙松柏，等．三叶青抗病毒作用的研究［J］．湖北中医杂志，1989(4):40.

［2］钟晓明，毛庆秋，黄真，等．三叶青提取物对烫伤大鼠肠道局部和全身免疫功能的影响［J］．中药材，2006，29(9):953.

［3］李瑛琦，陆文超，于治国，等．三叶青的化学成分研究［J］．中草药，2003(11):34.

［4］丁刚强，郑军献，魏克民，等．三叶青提取物对肝癌细胞HepG-2及原代大鼠肝细胞的体外毒性作用研究［J］．浙江预防医学，2005，17(9):122.

［5］冯正权，倪克锋，何煜，等．三叶青黄酮诱导 SGC-7901胃癌细胞凋亡的实验研究［J］．中国临床药理学与治疗学，2006，11(6):669.

［6］毛一亮，张佳佳，丁萍月，等．正交设计法优化三叶青中总黄酮的提取工艺［J］．西北药学杂志，2008，12(28):369.

［7］蒋新龙．广玉兰叶、花总黄酮提取方法与含量比较［J］．浙江农业科学，2010(3):648－650，664.