RP-HPLC法同时测定双丹口服液中没食子酸、丹参素和原儿茶醛的含量

李 骅 谢艳华 张邦乐 王剑波 杨 倩 曹 蔚 王四旺

1.第四军医大学药学系药物研究所，陕西 西安 710032；2.第四军医大学药学系药剂学教研室，陕西 西安 710032

双丹口服液收载于《中国药典》2010年版一部，是由丹参、牡丹皮两味中药组成的成方制剂，具有活血化瘀、通络止痛之功效，临床多用于瘀血痹阻所致的心胸痹痛[1]。丹参素、原儿茶醛和没食子酸分别为丹参、牡丹皮中的重要活性成分[2-5]，现行质量控制标准仅将丹参素作为双丹口服液的指标性成分进行含量测定，而原儿茶醛和没食子酸作为药材的主要有效成分，与全方药效密切相关。因此，同时测定这3种成分的含量对于双丹口服液的质量控制具有重要的意义。本实验建立了分离效果好、专属性强、灵敏度高的反相高效液相色谱法（RP-HPLC）同时测定双丹口服液中丹参素、原儿茶醛和没食子酸含量的方法，可为完善双丹口服液的质量控制标准提供参考[1,6-8]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC2010-AT高效液相色谱仪（Shimadzu，日本），包括紫外可见波长检测器、柱温箱、LC Solution色谱工作站；赛多利斯ME235S电子分析天平（Sartorius，德国）。

1.2 试药

双丹口服液 （北京嘉事大恒制药有限公司，批号：090709、100608、100706）；没食子酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110831-200302），丹参素钠对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110855-200706），原儿茶醛对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110810-200506）；甲醇为色谱纯（Honeywell，美国，纯度为70%），水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Sino Chrom ODS-BP C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）柱；流动相：甲醇-3%冰醋酸（8∶92）；检测波长：280 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别取对照品没食子酸、丹参素钠、原儿茶醛适量，精密称定，置于同一10 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇溶解并定容，制成混合对照品储备溶液，浓度分别为1.50、1.00、1.00 mg/mL。所得对照品储备液4℃冰箱避光、密封保存，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密吸取1 mL双丹口服液于50 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度；取适量稀释液，10714r/min高速离心15 min，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，作为供试品溶液。

2.2.3 阴性溶液的制备 按处方工艺制备不含丹参、牡丹皮的样品，按供试品溶液制备方法制备阴性溶液。

2.3 系统适应性试验

照上述色谱条件，精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各20 μL，分别注入色谱仪，记录色谱图，可见供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应的位置上，均有相同保留时间的色谱峰，同时3个待测组分没食子酸、丹参素、原儿茶醛色谱峰与相邻峰的分离度均大于1.5，阴性样品对测定无干扰，见图1。

图1 双丹口服液液相色谱图

2.4 线性关系考察

分别精密吸取上述混合对照品储备溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，用 70%甲醇稀释并定容于 10 mL容量瓶中。在上述色谱条件下，分别进样20 μL进行测定。结果以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，绘制标准曲线，计算得没食子酸、丹参素、原儿茶醛回归方程分别为：Y=48450X-77657 （r=0.9998）、Y=14275X-25376 （r=0.9999）、Y=84203X-35716 （r=0.9998）。结果表明，没食子酸、丹参素、原儿茶醛分别在5.0～100.0、7.5～150.0、5.0～100.0 μg/mL 范围内具有良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取同一浓度混合对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积。结果没食子酸、丹参素、原儿茶醛的RSD分别为为0.23%、0.50%、0.29%，表明在此试验条件下精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一批供试品溶液（批号：100608），分别于 0、2、4、6、8、10、12 h 进样 20 μL，测定峰面积。结果没食子酸、丹参素、原儿茶醛的RSD分别为0.62%、1.05%、0.52%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

精密称取同一批号供试品（批号：100608）6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别测定3个成分的峰面积，计算得供试品中没食子酸、丹参素、原儿茶酸含量分别为0.91、2.83、0.46 mg/mL，RSD 分别为 0.41%、0.21%、0.03%。

2.8 加样回收率试验

精密吸取已测知含量的同一批供试品（批号：100608）6份，每份1.00 mL，精密加入1 mL混合对照品储备溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定。没食子酸、丹参素、原儿茶醛加样回收率（n=6）依次为 99.2%、99.8%、100.3%，RSD 依次为 0.82%、0.94%、0.65%。

2.9 样品含量测定

取批号为090709、100608、100706双丹口服液，按制备供试品溶液方法制备样品溶液，精密吸取样品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定3次。见表1。

表1 双丹口服液中没食子酸、丹参素、原儿茶醛含量测定结果（mg/mL，n=3）

3 讨论

3.1 流动相的选择

没食子酸、丹参素和原儿茶醛极性均较大，宜采用水相比例较大的流动相，且由于受其结构中酚羟基的影响，都存在测定时易拖尾的现象，流动相中加入适量酸可抑制其拖尾，改善峰形对称性。考察了甲醇-1%冰醋酸水溶液[1]、甲醇-2%冰醋酸水溶液、甲醇-3%冰醋酸水溶液，测定显示采用甲醇-3%冰醋酸水溶液（8∶92，V/V）所得样品峰形好，干扰成分少，保留时间合适，故选此作为流动相。

3.2 色谱柱的选择

根据所选流动相，色谱柱应耐酸并能承受较大水相，试验中曾试用 Yilite Hypersil BDS C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）色谱柱、YiliteSinoChromODS-BPC18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱、PhenomenexLunaC18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱、Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，最后确定使用Yilite Sino Chrom ODS-BP C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm） 色谱柱。

3.3 其他色谱条件的选择

全波长扫描 （210～400 nm）结果显示没食子酸在230、273 nm有最大吸收，丹参素在234、281 nm，原儿茶醛在235、280和312 nm有最大吸收，因在230 nm附近溶剂峰对3个成分色谱峰干扰较大，故选择280 nm为检测波长。考察结果显示，柱温及流速等的改变对含量测定的结果影响不大。

3.4 溶液的制备

考察了甲醇、50%甲醇、70%甲醇作为溶剂溶解样品对色谱分离情况的影响，结果显示纯甲醇溶解样品会产生溶剂效应，使得色谱峰前延，影响分离效果。综合考虑，以70%甲醇为溶剂，其色谱峰对称性较好，基线也较平稳。

综上所述，本文建立的HPLC法能同时测定双丹口服液中没食子酸、丹参素和原儿茶醛的含量，方法操作简便，省时快捷，结果准确、可靠，可为完善双丹口服液的质量控制标准提供参考。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：610.

[2]李骅，王四旺，张邦乐，等.丹参素的药理活性与药物动力学研究进展[J].西北药学杂志，2011，26（4）：310-312.

[3]赵艳威，杨宣，董璨瑾，等.丹参素及原儿茶醛研究进展[J].武警医学院学报，2009，18（3）：260-262.

[4]黄泰康.常用中药成分与药理手册（下册）[M].北京：中国医药科技出版社，1994：1040.

[5]久保道德.牡丹皮的研究（第九报）-对小鼠吞噬功能的影响[J].国外医学：中医中药分册，1986，（4）：33.

[6]刘红亚，雷勇，杨大坚.RP-HPLC测定双丹口服液中丹酚酸B、丹参素和原儿茶醛的含量[J].中成药，2007，29（6）：839-842.

[7]张玲，于宗渊，李保国，等.紫外分光光度法测定双丹口服液中丹皮酚的含量[J].中药新药与临床药理，1995，6（4）：46-47.

[8]张玲，徐新刚，时延增，等.双丹口服液中原儿茶醛的含量测定[J].时珍国医国药，1996，7（3）：148-149.