HPLC法测定注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠（2∶1）的含量

黄 琦，季晓娟

（浙江科技学院 生物与化学工程学院，杭州310023）

头孢哌酮钠（cefopcrazone sodium，CPZ）和舒巴坦钠（sulbactam sodium，SBT）（2∶1）组成的复方制剂不但对阴性杆菌显示明显的协同抗菌活性，联合后的抗菌作用是单独用头孢哌酮的4倍。本品对金葡萄球菌，G－杆菌产生的β－内酰胺酶有很强的抑制作用，临床上用于多种感染疾病的治疗［1－2］。头孢哌酮钠产品中除药用形式R构型外，还有对革兰阴性杆菌几乎无效的S异构体、碱性降解产物B、未知杂质等，严重影响着产品质量［3－4］。该复方制剂含量测定方法需能同时测定头孢哌酮钠与舒巴坦钠，且主药与头孢哌酮S异构体、头孢哌酮碱性降解产物B及头孢哌酮未知杂质达到同时分离。该复方制剂按中国药典（2010版）收载的注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠的含量测定方法［5］，色谱条件的适用性不能满足测定要求，不同的色谱柱头孢哌酮和其S异构体之间的分离度差异较大，有的难以达到规定要求。本研究探讨了头孢哌酮钠和舒巴坦钠（2∶1）含量测定用流动相，所确定的色谱条件改善了头孢哌酮和S异构体的分离度，同时改善了舒巴坦和头孢哌酮未知杂质的分离度；该方法准确、可靠，具有较好的适用性。

1 仪器与试药

岛津LC－10AT液相色谱仪，岛津SPD－10A紫外检测器，岛津ODS色谱柱（150mm×6.0mm，5μm），岛津UV－2100紫外可见扫描仪，pHS－25型酸度计。

头孢哌酮对照品（质量分数94.4%），舒巴坦对照品（质量分数92.0%），头孢哌酮S异构体对照品，头孢哌酮降解物B对照品，均为中国药品生物制品检定所提供；注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠（深圳制药厂，批号101201，101202，101203）；乙腈（色谱纯），10%四丁基氢氧化铵水溶液（上海试剂一厂），磷酸二氢钾（化学纯）。

2 实验方法及结果

2.1 检测波长的选择

图1 4种化合物的紫外扫描谱图Fig.1 UV spectrum of 4kinds of chemicals

取头孢哌酮对照品、舒巴坦对照品、头孢哌酮S异构体、头孢哌酮降解物B各10mg，精密称定。头孢哌酮对照品和S异构体先用少量pH7.0磷酸盐缓冲液溶解，再用流动相稀释至刻度；头孢哌酮B降解物先用少量乙腈溶解，再用流动相稀释至刻度；舒巴坦用流动相溶解并稀释至刻度。配成质量浓度为20μg/mL的溶液，在UV－2100紫外可见扫描仪扫描得紫外光谱（图1）。由于舒巴坦的吸收偏低且含量较小，其他3个成分在吸收峰的平坦处，故选择220nm作为检测波长。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

十八烷基硅烷键合相为固定相；流动相为乙腈－水相（23∶77），水相为浓度0.005mol/L氢氧化四丁基铵和0.05mol/L KH2PO4溶液；pH5.0；流速1.0mL/min；检测波长220nm；进样量20μL；室温。同时精密称取头孢哌酮对照品、舒巴坦对照品、头孢哌酮S异构体对照品及头孢哌酮降解物B对照品适量，头孢哌酮对照品和头孢哌酮S异构体对照品先用少量pH7.0磷酸钠缓冲液溶解，降解物B对照品先以乙腈溶解，再加流动相稀释成头孢哌酮、头孢哌酮降解物B、头孢哌酮S异构体质量浓度为0.3mg/mL，舒巴坦质量浓度为0.15mg/mL的混合溶液，进样测试。头孢哌酮峰与头孢哌酮S异构体峰的分离度，舒巴坦峰与未知杂质峰的分离度应不小于1.0。

结果表明，色谱图中相邻两峰的分离度良好（图2），理论塔板数按头孢哌酮峰计算大于3 000，系统适用性试验符合规定。

图2 系统适用性试验色谱图Fig.2 Chromatogram of system suitability test

2.3 标准曲线

2.3.1 头孢哌酮和舒巴坦标准储备液的制备

精密称取头孢哌酮对照品25.0 mg，舒巴坦对照品12.5mg，置25 mL容量瓶中，先用少量pH7.0磷酸盐缓冲液溶解，再用流动相稀释至刻度，混匀，配成头孢哌酮1.0mg/mL、舒 巴 坦 0.5mg/mL 标 准 储备液。

2.3.2 标准曲线

精密吸取上述标准储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置 6 个10mL容量瓶中，加流动相至刻度，摇匀，即配成含头孢哌酮0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL，舒巴坦0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mg/mL的系列标准溶液。照上述色谱条件测定。经回归计算，色谱峰面积（A）与质量浓度（C）在头孢哌酮0.049～0.49mg/mL，舒巴坦0.024～0.24mg/mL范围内呈良好的线性关系，回归方程：

头孢哌酮A＝1.87×107C＋4.10×104，r＝0.999 4

舒巴坦A＝3.69×106C＋4.11×103，r＝0.999 1

2.4 进样精密度

取头孢哌酮质量浓度为0.2mg/mL，舒巴坦质量浓度为0.1mg/mL的标准溶液20μL进样，连续测定6次，计算其相对标准偏差（RSD），分别为0.73%，0.70%，见表1。

表1 精密度测定结果（n＝6）Table 1 Determination results of precision（n＝6）

2.5 检测限

取上述制备标准曲线用最低质量浓度的头孢哌酮和舒巴坦标准溶液，采用逐步稀释法，检测限以信噪比S/N＝3确定。结果表明，头孢哌酮的检测限为1.0ng，舒巴坦的检测限为2.0ng。

2.6 回收率试验

精密称取20倍处方量已知含量的舒巴坦原料9份，各加入精密称取已知含量的头孢哌酮原料，称样量为20倍处方量的80%、100%、120% 各3份，混合均匀制成模拟样，精密称取模拟样适量（约相当于头孢哌酮12、15、18mg），分别置于50mL容量瓶中；同样精密称取20倍处方量已知含量的头孢哌酮原料9份，各加入精密称取已知含量的舒巴坦原料，称样量为20倍处方量的80%、100%、120%各3份，混合均匀制成模拟样，精密称取模拟样适量（约相当于舒巴坦6.0、7.5、9.0mg），分别置于50mL容量瓶中；用流动相稀释至刻度。

另精密称取头孢哌酮、舒巴坦对照品，先用少量pH7.0磷酸盐缓冲液溶解，再用流动相稀释至刻度，混匀，配成头孢哌酮0.3mg/mL、舒巴坦0.15mg/mL标准储备液，按上述色谱条件进样测定，计算回收率，结果见表2。结果表明，本方法回收率较好，两成分互不干扰。

2.7 样品含量测定

取厂家3个批号注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠（2∶1）适量，分别精密称定，制成含头孢哌酮3.0mg/mL，舒巴坦1.5mg/mL的溶液，按照上述色谱条件进样测定，记录色谱图。3批样品测定结果见表3。

表2 回收率试验（n＝9）Table 2 Recovery test（n＝9） %

表3 样品测定结果（n＝3）Table 3 Determination results of samples in different batches（n＝3） %

3 讨 论

3.1 中国药典（2010版）收载方法的流动相分离情况考察

中国药典（2010版）收载的注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠含量测定的流动相：0.005mol/L氢氧化铵四丁基溶液（取40%氢氧化四丁基铵溶液6.6mL，加水1 800mL后，用1mol/L磷酸溶液调节pH值至4.0，再用水稀释至2 000mL，摇匀）—乙腈（750∶250）检测波长220nm［5］。在该色谱条件下，头孢哌酮峰和S异构体峰的分离度较好，但是两者峰形不尖锐，有些拖尾，并且保留时间较长（大于30min）；舒巴坦色谱峰前有一未知杂质，和舒巴坦峰的分离度小于1.0。

3.2 流动相组成对被测组分色谱分离的影响

流动相有乙腈比例、pH值、KH2PO4溶液质量浓度、氢氧化四丁基铵溶液质量浓度4个可变因素，用正交试验优选色谱条件发现：氢氧化四丁基铵溶液质量浓度可以增加舒巴坦的保留；磷酸盐缓冲液可改善头孢哌酮和S异构体的峰形和分离度及改变B降解物的峰位；pH值对各峰的保留时间均有影响；流动相中乙腈比例影响最大，尤其对头孢哌酮的保留时间影响较大。当水相与乙腈的比为77∶23时，可使相邻峰的分离度达到要求，各峰峰宽较合适，且保留时间较为适宜（未知杂质6.665min，舒巴坦7.068min，B降解物8.715min，头孢哌酮18.665min，头孢哌酮S异构体20.265min）；流动相中水相的pH值在4～6范围内，对舒巴坦和头孢哌酮未知杂质的分离度影响较大，当pH5.0时，可使舒巴坦和头孢哌酮未知杂质的分离度符合要求（R＞1.0）；用KH2PO4缓冲液保持流动相的离子强度和pH值一定，当KH2PO4的质量浓度为0.05mol/L时，有利于获得对称的色谱峰和重现的分离结果。

4 结 语

本研究探讨了注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠（2∶1）含量测定用流动相，改进后的流动相改善了头孢哌酮和S异构体、舒巴坦和头孢哌酮未知杂质的分离度，相邻两组分的分离度均不小于1.0，且保留时间较为适宜，优于中国药典（2010版）收载的流动相。所确定的色谱条件能准确、快速地测定该复方制剂中头孢哌酮钠和舒巴坦钠的含量。

［1］王婷，孙渊.头孢哌酮舒巴坦钠临床应用研究进展［J］.海峡药学，2010，22（7）：173－176.

［2］王连水，刘永利，高燕霞.注射用头孢哌酮钠舒巴坦钠的质量评价［J］.中国药事，2010，24（4）：403－404，413.

［3］张慧文，胡昌勤，许明哲，等.胶束电动毛细管色谱法分析头孢哌酮与其S－异构体等杂质［J］.色谱，2007，25（5）：699－704.

［4］陈兆坤，胡昌勤.头孢菌素类抗生素的降解机制［J］.国外医药：抗生素分册，2004，25（6）：249－252，265.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：796.