GC/MS法和 UPLC/Q-TOF-MS法研究丹香冠心注射液中的有效成分

王少敏， 胡 青， 季 申

(上海市食品药品检验所，上海201203)

丹香冠心注射液是一种常用的中药注射液，具有活血化瘀，理气开窍的功能，临床用于冠心病、心绞痛、心肌梗死属瘀血闭阻证等。其不良反应主要为过敏反应，如静滴时引起头痛、药疹、药物热、皮肤瘙痒等，少量严重不良反应为静脉炎和过敏性休克、呼吸困难、喉水肿。为明确丹香冠心注射液的组成成分以进一步控制质量安全，对其进行物质基础研究成为必要。

中药注射液是一个复杂系统，物质成分众多，类别多样，性质差异大，大量成分含量低。传统的物质基础研究方式多采用色谱吸附分离技术得到纯度高的单体化合物后，再获取光谱和质谱数据，进行结构鉴定。该方法需要大量的人力物力，耗时长，分离鉴定含量低的成分难度大。近年来，色质联用技术发展迅速，如气相色谱/质谱联用技术(GC－MS)可用于实现挥发油成分快速分离定性，而液相色谱/质谱联用技术则是研究中药中非挥发性成分的重要手段，其中超高效液相-四级杆/飞行时间串联质谱(UPLC-Q/TOF-MS)技术具备分析速度快、高灵敏度、准确质量和全谱记录等特点，可以提供准确的质量数、碎片信息和可能结构，对于未知化合物的鉴定是强有力的工具［1］。

丹香冠心注射液处方由丹参、降香两味药组成，主要工艺为丹参水提醇沉酸碱除杂，降香水蒸气蒸馏挥发油，二者合并。根据工艺推测，最终产品中应含有丹参水溶性成分和降香的挥发性成分。本实验分别采用GC/MS和UPLC-Q/TOF-MS技术，对其物质基础进行了研究。

1 仪器与试药

美国安捷伦公司Agilent 6890N GC/5973N MSD气相质谱联用色谱仪;MSD Chemistation D 03.00.611数据处理系统;美国Waters Acquity@ 超高效液相谱仪色谱仪;美国 Micromass Synapt Q-TOF-MS(四级杆－飞行时间质谱仪);Epppendorf 5810R台式离心机。甲醇、乙腈为色谱纯，由Fluca公司提供，石油醚、乙酸乙酯为农残级纯，由Merck公司提供，

标准物质:反式 －苦橙油醇对照品(批号:0001421969，Sigma公司);降香挥发油对照品(批号:111579-200201);丹参素钠(批号:110855-200203);原儿茶醛(批号:110810-200205);丹酚酸 B(批号:111562-200302);原儿茶酸(批号:809-200102)均购自中国药品生物制品检定所。

丹香冠心注射液:批号:0909025、091003、0911083、0912048、0912065、1001036、1002019、1002060、1003035、1003054(生产企业 A:上海中西制药有限公司);批号:090508、090510、090720、090812、090917、091101、091107、091222、100304、100306(生产企业B:上海新亚药业高邮有限公司)。

2 溶液的制备

2.1 对照品溶液的制备

2.1.1 GC－MS对照品溶液 取降香挥发油和反式－苦橙油醇对照品适量，分别加乙酸乙酯制成每1 mL含0.1 mg的对照品溶液。

2.1.2 UPLC-Q/TOF-MS对照品溶液的制备 取丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、原儿茶酸等对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 GC－MS供试品溶液 取丹香冠心注射液10 mL，置具塞试管加入2 mL石油醚，涡旋2 min，静置，待分层后，取上清液，备用，下层溶液中加入2 mL乙酸乙酯，涡旋2 min，静置，待分层后，取上清液，石油醚液与乙酸乙酯溶液作为不同极性部位供试品溶液进行分析。同时不取样品溶液，按上述方法，制备相应随行空白溶液。

2.2.2 UPLC-Q/TOF-MS供试品溶液 取丹香冠心注射液，过0.22 μm的滤膜，取续滤液，即得。

3 色质联用条件

3.1 GC-MS条件 色谱柱:Agilent Innowax毛细管色谱柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);升温程序:初始温度100℃，以2℃/min的速率升温至200℃并保持5 min，载气:氦气，体积流量1.2 mL/min;分流比1∶1;进样体积1 μL;进样口温度:280℃;气质接口温度:250℃;电离方式:电子轰击(E I);电离能量:70 eV;扫描质量范围:30～600 AMU;扫描间隔:0.5 s。

3.2 UPLC-Q/TOF-MS 条件 UPLC BEH C18色谱柱(1.7 μm，2.1 mm ×50 mm);流动相 A 为乙腈，B为0.01%甲酸溶液，体积流量0.3 mL/min;柱温25℃;进样量10 μL。采用以下两种梯度洗脱程序分别对应Q/TOF-MS的正、负离子检测模式:①0～30 min，5%→30%A;30 ～60 min，30%→50%A，60 ～90 min，50%→70%A，90 ～100 min，70%→95%A;100～110 min 5%A;②:0 ～5 min，5%A;5 ～90 min，5%→22%A，90 ～95 min，22%→95%A，95 ～100 min，5%A。

质谱条件:电喷雾离子源(ESI);采用正、负离子两种模式检测，毛细管电压为3200 V，锥孔电压为35 V，检测器电压为2000 V;脱溶剂气流为600 L/h，脱溶剂气流为350℃，锥孔气流量为50 L/h，离子源温度为120℃，0.2 s采集一次谱图;质量校正液(Lockspay)为亮氨酸-脑啡肽(leucine－enkephalin，［M+H］+=556.2771，［M － H］－=554.2615)，质量扫描范围:m/z 50 ～900。

4 结果

4.1 挥发性物质 对2个厂家的20批样品进行检测，结果各厂家生产的10批样品图谱基本一致，结合所有供试品溶液总离子流图谱，扣除相应的随行溶剂空白中的干扰峰，共检出25个色谱峰，见图1。对相对质量分数为99%的19个峰进行质谱扫描后得到质谱图，经与Nist数据库和对照品匹配，鉴定出反式－苦橙油醇等6个化合物，另13个化合物经推断均为苦橙油醇系列衍生物，其中12个化合物组成了三组同分异构体。按各色谱峰的质谱裂片图与文献核对［2-6］，对基峰、质荷比和相对丰度等方面进行直观比较，分别对各个色谱峰加以确认，综合各项分析鉴定，其中第一组同分异构体:峰5，7，11，12，20(保留时间为 32.6 min，33.5 min、41.2 min、41.7 min、46.5 min)的质谱图与文献报道的氧化苦橙油醇一致，推断该5个色谱峰为氧化苦橙油醇5个同分异构体。第二组同分异构体由峰3，4，6，8，14(保留时间分别为 31.9 min、32.3 min、32.8 min、33.6 min、43.2 min)组成，对其质谱裂片信息进行解析，推测其可能结构为氧化苦橙油醇的一个氢原子被羟基取代。第三组同分异构体:峰13和峰15(保留时间分别为42.7 min、44.2 min)的质谱图中具有与第二组相似的裂片:m/z 55.1，m/z 70.0，m/z 125.1，m/z 195.2，而峰 18(保留时间为 46.0 min)则具有与第三组相似的裂片信息:m/z 55.1，m/z 70.0，m/z 111.1，m/z 125.1，m/z 195.2，说明其均为结构相似的苦橙油醇系列化合物，见表1和图1～2。

图1 对照品及丹香冠心注射液样品GC/MS总离子流图Fig.1 GC/MS ion chromatograms of reference substances and Danxiang Guanxin Injetion

4.2 水溶性成分 同一厂家生产的10批样品图谱基本相似，丹香冠心注射液中水溶性成分主要为来自丹参中的酚酸类物质，在负离子模式下容易带电荷，另外，为保证某些成分在正离子模式下响应较好，质谱上分别对负离子和正离子两种模式进行采集，获得的化合物相互进行补充，按3.2项分析条件，绘制UPLC/Q-TOF-MS BP I正、负离子扫描总离子流图，见图3。根据部分标准品定位和文献进行鉴定［7-12］，结果负离子模式中响应峰较多，鉴别出24个化合物，正离子模式中鉴别出6个化合物，其中5个已在负离子质谱图中发现，故共鉴定了图谱中的25个主要色谱峰，见图3和表2。

表1 丹香冠心注射液中挥发性成分Tab.1 The volatile compounds in Danxiang Guanxin Injection

图2 反式－苦橙油醇对照品及系列衍生物GC/MS质谱裂片图Fig.2 GC/MS fracture ion chromatograms of reference substances and it’s derivatives

图3 丹香冠心注射液的UPLC/Q-TOF-MS总离子流图(正、负离子模式)Fig.3 UPLC/Q-TOF-MS total ion chromatograms of reference substances and Danxiang Guanxin Injetion

表2 丹香冠心注射液水溶性成分Tab.2 The water-soluble compounds in Danxiang Guanxin Injection

(续表2)

5 讨论

5.1 为完全提取不同极性的挥发性成分，采用石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇不同溶剂依次提取丹香冠心注射液样品，结果表明三氯甲烷、正丁醇部位总离子流图中基本无色谱峰，说明石油醚和乙酸乙酯已基本将挥发性成分完全提取。

5.2 对非极性和极性两种气相色谱柱进行了考察，并配以相适应的升温程序，① HP-5毛细管色谱柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);梯度升温程序为初始80℃，保持10 min，以5℃/min升至280℃;② Agilent Innowax 毛细管色谱柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);梯度升温程序为初始100℃，以2℃/min升至200℃，保持5 min。结果后者对色谱峰分离度更好，选择柱②进行分析。

5.3 对UPLC色谱条件进行了考察，采用不同填料(C18和T3硅胶)、不同长度(50 mm，100 mm，150 mm)的3根色谱柱进行了试验，结果以C18填料、柱长50 mm的UPLC色谱柱得到的谱图中色谱峰多且分离度好。以乙腈-0.01%甲酸溶液为流动相体系，进行梯度洗脱，乙腈由5%变化至95%，结果发现因样品中水溶性成分主要为酚酸类，极性较强，多出现在5%～40%乙腈比例，故最终确定以较低乙腈比例的流动相体系进行洗脱，使各化合物分离良好。

5.4 对目前国内市场上的丹香冠心注射液进行了收集，发现目前市场上的丹香冠心注射液均由上海中西制药有限公司和上海新亚药业高邮有限公司两家企业生产。另有获得批准文号的四家生产企业未进行生产。对上述两个厂家产品各10批样品进行物质基础研究发现，同一厂家的10批产品得到的图谱非常相似;两个厂家的水溶性部分成分和强度基本相似，而挥发性成分差别较大。上海中西制药有限公司的丹香冠心注射液总离子流图中色谱峰个数较多，且峰强度较大，与降香挥发油对照品图谱相比，多出包括三组同分异构体共十余个峰，但无反式－苦橙油醇的峰。而上海新亚药业高邮有限公司的丹香冠心注射液总离子流图中峰个数较少，整体与降香挥发油对照品的图谱相似，反式－苦橙油醇色谱峰较明显，见图1。推测两家产品的差异可能是由降香原料和生产工艺中参数的不同造成。

5.5 本次物质基础研究表明，丹香冠心注射液中的挥发性成分主要由苦橙油醇及其衍生物组成，水溶性成分主要由丹参中的酚酸类成分组成，与根据工艺推测的结果一致。

5.6 色质联用技术具备分析速度快、高灵敏度、准确质量和全谱记录等特点，可以提供准确的质量数、碎片信息和可能结构，对于未知化合物的鉴定是强有力的工具。本实验采用两种色质联用技术对已有标准品的化合物进行了准确的定性，并通过质谱碎片信息的研究对丹香冠心注射液中同类组分或同系组分进行大概的结构推测，说明是色质联用技术研究物质基础的有力工具，也为物质基础的研究提供了一种思路。

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