不同提取方法制备的葛根芩连配方颗粒抑菌药效研究

陈丽红， 唐于平， 王 强

(1.南京中医药大学药学院，江苏南京210046;2.南京中医药大学江苏省方剂研究重点实验室，江苏南京210046;3.中国药科大学中药分析教研室，江苏南京210009)

葛根芩连汤来源于东汉末年张仲景所著的《伤寒论》。其组成为:葛根半斤，甘草二两 (炙)，黄芩三两，黄连三两［1-3］。葛根芩连汤具有解肌、清热、止泻止痢之功效，临床用于泄泻痢疾、身热烦渴、下痢臭秽、菌痢、肠炎等［4］。葛根芩连汤药味较少，作用明确，是中医药的经典方剂，一直是研究的热点。汤剂为葛根芩连汤原始剂型，目前已经上市的葛根芩连方剂型有片剂、胶囊剂、口服液、微丸等［4-7］。

中药配方颗粒服用剂量小、储存和携带方便。本研究为了优化葛根芩连配方颗粒的提取工艺，选用金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌进行抑菌药效学实验研究［8-11］，为工艺优化提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株 菌种金黄色葡萄球菌 (26003)、痢疾杆菌 (10104)、大肠杆菌 (44102)、绿脓杆菌 (10125)、伤寒杆菌 (50097)购自中国药品生物制品检定所，为微生物教研室保存菌种。

1.2 器材 试管、试管架、平皿、移液器、接种环、烧杯、三角烧瓶等 (取自来水冲洗10次，一次蒸馏水冲洗3次，二次蒸馏水冲洗3次，牛皮纸包扎，于180℃烘箱烘2 h，备用);酒精灯 (消毒用)，75%酒精、碘酊、棉球。氯化钠注射液，南京小营制药有限公司，批号:2005060804，规格:500 mL/瓶。

1.3 仪器设备 高压消毒灭菌器 (上海医疗器械五厂);二氧化碳孵箱 (南京医疗器械厂)。

1.4 培养基 营养琼脂，购于杭州微生物试剂有限公司，批号:20040512(成分:蛋白胨10 g，琼脂17 g，牛肉浸出粉3 g，NaCl 5 g)。用法:取本品35 g加于1000 mL蒸馏水中，微微加热至溶解，趁热校正pH至7.4～7.6，分装于试管中，加棉塞。于121℃、20 min高压灭菌，冷却后置于4℃冰箱备用。

1.5 饮片及制剂

饮片:葛根、黄芩、黄连、甘草饮片经鉴定符合《中国药典》2010年版一部的规定。

葛根芩连配方颗粒分煎剂:称取同批药材，根据葛根、黄芩和炙甘草三药合煎和黄连单煎中试工艺。葛根、黄芩和炙甘草三药合煎加水量第一煎10倍，第二煎8倍;提取1.5 h;提取2次;提取液经浓缩、喷雾干燥得到浸膏粉。黄连单煎加水量第一煎12倍，第二煎10倍，提取1.5 h，提取2次;提取液经浓缩、喷雾干燥得到浸膏粉。将相应比例的黄连中间体浸膏粉与葛根、黄芩及炙甘草三药合煎的浸膏粉混合均匀，得全方干燥粉，灌装得成品［12］。取制备得到的配方颗粒适量，加水溶解超声。

葛根芩连配方颗粒合煎剂:称取同批药材，根据葛根、黄芩、黄连与炙甘草四药合煎中试工艺制备得到的配方颗粒适量，加水溶解超声。

1.6 试验方法

1.6.1 含药培养基配制 以样品配制好的待试灭菌药液按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16的比例加入培养基中，制成平板。

1.6.2 供试菌液制备 将各标准菌株经画线接种培养后，挑选典型菌落接种于2 mL营养肉汤培养基。37℃培养24 h，试验时做10－2稀释。

1.6.3 最低抑菌质量浓度测定 将样品配制成1.0、0.50、0.25、0.125、0.0625、0.03125 g/mL系列质量浓度，然后按比例加入培养基中，使成 0.50、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 g/mL的含药培养基，经高压灭菌消毒，制成含药琼脂平板。

取经过分光光度计测定校正过细菌浓度的待检菌液(108CFU/mL)，以点种法用接种环分别取不同的菌液接种于含药琼脂表面的平板内 (每点分别接种0.05 mL金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌)，从含最低药物浓度的琼脂平板接种起，每个接种点的直径约为2～3 mm，置37℃孵箱内培养24 h。培养结束后取出，观察上述各种细菌在不同浓度的药物平板中的生长情况。每次试验设立对照 (培养基加菌液)。每种试验重复3次。判断标准:以含药平板中细菌未生长的最低药物浓度，为药物对该细菌的最小抑菌浓度。

2 结果

葛根芩连配方颗粒分煎剂和合煎剂对绿脓杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌及伤寒杆菌均有一定的抑菌作用，尤其是对金黄色葡萄球菌和伤寒杆菌。葛根芩连配方颗粒分煎剂对以上4种菌株的最低抑菌质量浓度分别为0.25000 g/mL、0.06250 g/mL、0.03125 g/mL、0.01563 g/mL，葛根芩连合煎剂的最低抑菌浓度质量分别为0.50000 g/mL、0.12500 g/mL、0.25000 g/mL、0.01563 g/mL，表明对绿脓杆菌、痢疾杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用，分煎剂强于合煎剂。结果见表1。

表1 不同提取方法制备的葛根芩连配方颗粒的MIC测定结果 (平板法)

3 讨论

表1显示，葛根、黄芩与炙甘草三药合煎、黄连单煎制备的葛根芩连配方颗粒对绿脓杆菌、痢疾杆菌尤其是对金黄色葡萄球菌的抑菌作用显著强于四药合煎制备的配方颗粒。

据文献报道，葛根芩连汤全方对埃希氏大肠杆菌抑制作用的药物主要为黄芩与黄连［13］。黄芩、黄连对金黄色葡萄球菌的抗菌作用明显优于痢疾杆菌，其体外抗菌强度黄连优于黄芩［14］。黄连的体外抑菌活性成分是小檗碱［15］。黄芩主要成分是黄芩苷等黄酮类成分［16］。在葛根芩连复方四药合煎时，黄芩对小檗碱含有量的影响最大，甘草次之，葛根对小檗碱含有量也有影响，但影响最小［17］。小檗碱类生物碱呈碱性，黄酮类化合物偏酸性，因此在葛根芩连配方颗粒合煎过程中，黄连中的生物碱成分与黄芩、葛根、炙甘草中的黄酮、皂苷类成分形成沉淀，使得研究用药液中的有效活性成分小檗碱与黄芩苷等黄酮类成分降低，从而导致抑菌作用尤其是对金黄色葡萄球菌的抑菌作用显著下降。

根据试验结果可知，为了保证其抑菌疗效，在制备葛根芩连配方颗粒时宜采用葛根、黄芩与炙甘草三药合煎、黄连单煎，以保证主要抑菌药效成分小檗碱与黄芩苷等黄酮类成分的充分提取。

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