睾酮水平的变化对雄性大鼠血管内皮功能的影响

谈世进，王艳妮，丁在咸

(1.上海交通大学附属第六人民医院老年病科，上海 200233;2.上海交通大学附属第六人民医院动物实验中心，上海 200233)

流行病学研究显示，老年男性随着年龄的老化体内雄激素水平也成逐渐下降的趋势，而心脑血管疾病的发病率和死亡率却逐步增加。以前的研究结果表明，老年男性冠心病患者靶器官损伤可能与雄激素水平低下密切相关［1］，但其作用机制尚不完全清楚。睾酮是雄激素中最具有活性的，它对于促进机体的生长发育、维持心血管功能等具有重要的生理作用。血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)通过合成和分泌多种血管活性物质在动脉粥样硬化(artherosclerosis，AS)的发生、发展中占有重要的地位和作用，一氧化氮(nitric oxide，NO)与内皮素-1(endothelin-1，ET-1)是内皮细胞分泌的调节和平衡血管舒缩功能而参与AS的重要因子。观察睾酮水平的变化对NO、ET-1的影响将有助于了解睾酮对VEC功能的影响，从而初步探讨睾酮在AS过程中的作用。本研究以雄性去势大鼠为实验模型，采用 NO、ET-1等指标，观察不同水平睾酮对VEC功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级雄性 Wistar-Kyoto(WKY)大鼠，3～4个月龄，体质量250 g左右，共30只，由中科院动物实验中心提供。

1.1.2 主要试剂和仪器 睾酮放免试剂盒(上海蓝基生物有限公司)，Sn-695B型γ放射免疫计数器，自动平衡式离心机，光学显微镜，大鼠血清内皮素ELISA试剂盒(B.G公司)，大鼠NO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，731型分光光度计等。

1.2 动物模型和组织标本的制备

1.2.1 大鼠去势模型的建立和分组 将30只雄性Wistar大鼠随机分为3组:单纯去势组、假手术组和补充睾酮组，每组10只。全部适用性喂养2周后开始实验。在腹腔注射氯胺酮10 mg/100 g麻醉后，需要去势的大鼠碘酒、酒精依次消毒阴囊皮肤，纵膈正中切开一纵行切口，剪开鞘膜后，分别将双侧睾丸与附睾分离，并且切除睾丸，然后把附睾放回阴囊，青霉素冲洗腹腔后逐层缝合皮肤，术后腹腔注射青霉素2×104U/d，共3 d;假手术组只找出双侧睾丸与附睾分离但不切除，然后放回阴囊。

1.2.2 动物饲养与给药 常规条件下分笼饲养，光线保持12 h昼夜循环，室温控制在27℃左右，湿度维持在40% ～50%，自由进水、进食，标准颗粒饲料。补充睾酮组，大鼠去势后2 d注射生理剂量睾酮2 mg/kg。

1.2.3 标本收集和处理 所有大鼠8周后取材。麻醉大鼠后，剖开胸腔，暴露心脏并取血，分别注入预先制备好的EDTA抗凝管及普通管，管口封闭好并颠倒混匀即放入4℃冰箱中1～2 h，取出后2 500 g 4℃离心7 min，分离出血浆或血清，取上清分装，检测血浆睾酮、一氧化氮(NO)及血清内皮素-1(ET-1)水平。放射免疫法测定睾酮水平、ELISA法定量检测血清ET-1水平、比色法测定NO水平，均严格按照试剂盒说明进行操作。

1.3 统计学处理

实验结果以±s表示，数据处理采用SPSS13.0统计软件，组间均数比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠血浆睾酮浓度的变化

较假手术组血浆睾酮浓度，单纯去势组明显降低(P＜0.05)，补充睾酮组无明显变化(P＞0.05)，见表1。

表1 3组大鼠血浆睾酮水平Tab.1 Plasma testosterone levels in 3 groups of rats±s)

表1 3组大鼠血浆睾酮水平Tab.1 Plasma testosterone levels in 3 groups of rats±s)

* 较假手术组，P ＜0.05，＊＊较单纯去势组，P ＜0.05

组 别 n 睾酮浓度/(ng·ml－1)单纯去势组 10 0.28 ±0.07*假手术组 10 2.47 ±0.53补充睾酮组 10 3.05 ±0.56＊＊

2.2 3组大鼠血浆NO含量变化

从表2可以看出，单纯去势组血浆NO水平明显低于假手术组，P＜0.05;补充睾酮组无明显变化，(P＞0.05)。

表2 3组大鼠血浆NO含量Tab.2 Plasma NO levels in 3 groups of rats ±s)

表2 3组大鼠血浆NO含量Tab.2 Plasma NO levels in 3 groups of rats ±s)

* 较假手术组，P ＜0.05，＊＊较单纯去势组，P ＜0.05

组 别 n NO 含量/(μmol·ml－1)单纯去势组 10 21.61 ±10.51*假手术组 10 33.44 ±8.50补充睾酮组 10 36.06 ±9.25＊＊

2.3 3组大鼠血清ET-1含量的变化

与假手术组比较，单纯去势组大鼠血清ET-1含量明显升高(P＜0.05);而补充睾酮组无明显变化(P＞0.05)。

表3 3组大鼠血清ET-1含量Tab.3 Plasma ET-1 levels in 3 groups of rats(±s)

表3 3组大鼠血清ET-1含量Tab.3 Plasma ET-1 levels in 3 groups of rats(±s)

* 较假手术组，P ＜0.05，＊＊较单纯去势组，P ＜0.05

组 别 n ET-1含量/(ng·ml－1)单纯去势组 10 4.41 ±0.34*假手术组 10 3.84 ±0.16补充睾酮组 10 3.95 ±0.23＊＊

3 讨 论

血管内皮功能障碍是动脉粥样硬化的始动因素，同时参与AS的发生、发展，而损伤的血管内皮细胞会发生形态和功能的改变，从而对血管的生理病理产生重要的影响，多种因素可引起血管内皮功能的损伤与减退，如糖尿病、高脂血症、高血压等等［2-3］。随着年龄的增长，人体内雄激素水平呈进行性下降的趋势，心血管疾病的发生率逐渐增加，提示体内雄激素水平的变化与心血管疾病的发生发展存在一定的联系。一些临床研究已经发现［1-4］，在老年患者中，随着体内雄激素水平的减少，其内皮功能与靶器官均出现损害，且表现出很强的相关性。目前雄激素对血管内皮细胞功能的影响的机制仍未阐明。付海霞等［5］研究内源性睾酮对球囊损伤的血管内皮细胞功能和结构的影响，结果电镜下观察到两组血管内膜均几乎完全被新生内皮覆盖，再生血管内皮细胞胞体肥大，轮廓模糊;光镜下观察发现两组血管内膜面积和内膜/中膜面积比值差异无显著性，提示内源性睾酮水平短时低于生理水平时对VEC再生、新生内膜形成无明显影响，但可能有改善损伤的VEC功能的倾向。而褚连军等［6］发现在性机能减退患者中，其体内的睾酮水平低下，同时伴有内皮祖细胞水平的降低，且使用磷酸二酯酶抑制剂伐地那非后内皮组细胞水平无改善;而补充睾酮达到生理量水平后，患者体内的内皮祖细胞水平恢复正常对照水平，且再次使用伐地那非后内皮组细胞水平有着明显改善，提示体内正常的睾酮水平是维持内皮祖细胞对磷酸二酯酶5抑制剂应答的必需条件。但也有体外实验研究结果显示睾酮可呈剂量依赖性地抑制VEC合成DNA及促进VEC的凋亡［7］。

VEC在体内起了极其重要的生理作用，其合成的具有强大的扩血管作用的血管活性物质是NO，而NO代谢紊乱则成为AS等内皮相关性疾病的重要因素。ET-1是VEC唯一产生的ET，具有强大而持久的缩血管作用。当VEC功能障碍时，合成和释放的NO与ET-1发生变化，引起血管舒缩功能异常、白细胞粘附调节障碍、血小板异常聚集和血栓形成等，这些都与AS的发生和发展有着密切的联系［8-9］。目前雄激素水平对内皮功能的影响结论不尽统一。有研究结果认为成年男性中内源性雄激素水平下降可改善内皮依赖性舒张功能［10］。国内有研究探讨不同浓度睾酮对脂多糖损害的体外培养的人脐静脉内皮细胞功能的影响，结果发现对于脂多糖损伤的内皮细胞低于生理剂量的睾酮也可以起促进NO的释放，但是NO水平明显低于正常对照组，当睾酮浓度越接近生理剂量时NO水平越接近对照组，提示睾酮对NO的作用效果与睾酮浓度相关［11］。也有研究发现生理浓度睾酮或接近生理浓度的睾酮对人脐静脉内皮细胞转化生长因子-β1和血红素加氧酶-1的表达呈时间和浓度依赖关系［12］。

本实验结果发现，单纯去势组血浆NO含量明显低于假手术组(P＜0.05)，而补充生理剂量睾酮后，其NO的水平有明显的升高;与假手术组比较，单纯去势组大鼠血清ET-1含量明显升高(P＜0.05)，而补充睾酮组的ET-1含量明显下降，提示单纯去势后使大鼠体内睾酮水平低于生理水平时对VEC存在一定程度的损伤，引起功能障碍，从而释放到外周血中的血管活性物质NO、ET-1发生变化。雄激素对心血管系统具有重要影响，在血管内皮受损过程中，睾酮可以促进内皮细胞增殖、迁移、修复，改善内皮功能。生理水平的雄激素可以抑制动脉粥样硬化的发生发展;可以改善脂质的代谢［13］。

总之，在本实验条件下提示雄激素缺乏可损伤血管内皮细胞，伴NO生成减少与ET-1释放增加，进一步促进AS的发生和发展。既往有研究结果表明雄激素水平降低与男性AS的发病率高密切相关［14］，但是AS的发生是多因素作用的结果，其中机制相当复杂，而雄激素在AS的进程中所起作用的机制尚未阐明，还需进一步研究来证实。

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