大鼠脊髓急性损伤后不同时间脊髓组织中iNOS阳性细胞与细胞凋亡的变化

王 欣，马汝逸，张文娟，韩宁娟，杨丽嘉，张广政#

1)郑州大学基础医学院法医学教研室郑州450001 2)郑州市第六人民医院口腔科郑州4500003)郑州大学药学院郑州450001

脊髓损伤是一种严重影响人类健康和生活质量的致残性损伤，在法医实践及临床中都比较常见。有研究［1］表明诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在正常健康的脊髓组织检测不到，但在病理状态下，被脊髓内的小胶质细胞和星形胶质细胞产生的细胞因子及内毒素诱导而表达，生成大量一氧化氮(NO)，过量的NO可以导致细胞凋亡。该实验通过改良的Allen’s法建立脊髓损伤模型，观察大鼠脊髓损伤后不同时间脊髓灰质和白质中iNOS以及细胞凋亡的变化，探讨其与脊髓损伤时间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 成年健康SD大鼠54只，雌雄不限，体质量250～300 g，由河南省实验动物中心提供。随机分为对照组(6只)和实验组(48只)。实验组根据伤后时间分为 3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d 组，每组6 只。

1.2 动物模型的建立 按改良的Allen’s法制作大鼠脊髓损伤模型。实验组大鼠用100 g/L的水合氯醛腹腔注射，注射剂量0.04 mL/kg，麻醉成功后，将其俯卧固定于手术台上，行背中段正中切口，切除T10～12锥板，暴露硬脊膜，用20 g砝码顺直玻管自10 cm处自由坠落(砝码与脊髓之间放一与暴露脊髓面积相当的自制垫片)，造成大鼠脊髓中度损伤，损伤瞬间可见大鼠出现后肢突然伸直的脊髓反射。对照组只进行椎板切除，不做打击即缝合。实验组大鼠术后后肢活动及排尿功能障碍，需每天早晚按摩大鼠膀胱2次，排空膀胱。

1.3 大鼠脊髓组织HE染色、灰质和白质内iNOS的免疫组织化学检测及细胞凋亡检测 实验动物处死前先麻醉，后用40 g/L多聚甲醛液快速心脏滴注20 min，心脏灌流后逐层剥开脊髓，取出损伤段约5 mm，多聚甲醛固定24 h后，石蜡包埋，5 μm厚切片，分别进行常规HE染色、iNOS免疫组织化学染色和原位末端标记(TUNEL)。均用PBS代替一抗作阴性对照，兔抗大鼠iNOS多克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司，TUNEL试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司。高倍视野下，每张切片在脊髓灰质和白质部位分别选取5个视野，计数iNOS阳性细胞(胞质可见棕黄色颗粒)，求均值;每张切片随机选取5个视野，计数凋亡细胞(凋亡细胞胞核呈明显的棕黄色)，计算凋亡指数，即阳性细胞百分率。

1.4 统计学处理 使用SPSS 10.0处理数据，应用单因素方差分析及LSD-t检验比较大鼠脊髓损伤后不同时间iNOS阳性细胞数和细胞凋亡指数的变化。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 脊髓组织病理学变化 对照组未见明显改变。实验组损伤早期(3 h～3 d)脊髓实质内可见出血点;神经元肿胀，体积增大，核膜不清，周围出现空隙;毛细血管扩张充血，炎细胞附壁。损伤后3 d可见脊髓组织疏松;神经元周围出现较多空隙，神经元数量减少，胶质细胞增生;损伤血管周围可见大量淋巴细胞和单核巨噬细胞聚集。14 d后组织损伤处灰白质分界渐清，水肿及出血消失，有炎细胞浸润，纤维组织增生(图1)。

2.2 大鼠脊髓损伤后iNOS阳性细胞数及细胞凋亡情况 见图2、3，表1。

图1 实验组损伤后不同时间组织病理学变化(HE)

表1 大鼠脊髓损伤后不同时间iNOS阳性细胞数和凋亡指数的变化(n=6)

3 讨论

NO参与很多疾病的发病过程，但检测比较困难［2］。NOS是NO合成的关键酶，其中iNOS的活性最大且作用时间最长，正常生理情况下几乎不表达，但是当机体受到外界干扰时，如外伤、炎症、肿瘤、自身免疫性疾病等，iNOS 将大量表达［3］。有实验［4］表明脊髓前角内NOS的活性升高产生一定量的NO，能促进脊髓损伤大鼠后肢功能改善。胡培高等［5］的研究也表明，脊髓损伤后NOS表达的适当升高对脊髓继发性损伤应该有保护作用，而大量的NO生成则会加快凋亡细胞的生成，造成不可逆的功能障碍。

该研究结果显示脊髓损伤后3 h，脊髓灰质和白质中iNOS阳性细胞开始增多，1 d后脊髓灰质和白质中阳性细胞均多见，3 d时脊髓灰质和白质中阳性细胞数明显增加，达到高峰，持续到伤后7 d，14 d后阳性细胞减少。各实验组脊髓灰质内iNOS阳性细胞明显多于白质，并且多为较大的神经元细胞，阳性特征明显，这为脊髓损伤定位提供了参考。脊髓损伤12 h后脊髓细胞开始以凋亡方式死亡，主要集中于损伤部位，脊髓灰质和白质中均可见凋亡细胞，主要为胶质细胞凋亡，神经元凋亡少见，至损伤后7 d达高峰，高峰期白质脱髓鞘的部位有大量凋亡细胞，提示胶质细胞发生凋亡在脊髓损伤的病理生理过程中占主要作用。由实验结果可以看出，脊髓损伤后iNOS阳性细胞的变化与凋亡细胞的变化基本一致，随着iNOS阳性细胞数达到高峰，凋亡细胞也在损伤后7 d达到高峰，随后都有所下降，这也进一步证实了iNOS介导生成的NO在细胞凋亡中起着关键作用［6］。二者都是脊髓损伤后反映损伤时间的敏感指标，其变化呈现一定的时序性，因此有可能作为法医学中判断脊髓损伤时间的新指标;同时也可能为脊髓损伤患者的诊断与治疗提供理论参考。

［1］Nishio E，Fukushima K，Shiozaki M，et al.Nitric oxide donor SNAP induces apoptosis in smooth muscle cells through cGMP-independent mechanism［J］.Biochem Biophys Res Commun，1996，221(1):163

［2］王炜煜，秦启生.一氧化氮合成酶及其在脑损伤研究中的法医学意义［J］.中国法医学杂志，2003，18(3):188

［3］周志军.缺氧脑组织与一氧化氮及其合酶［J］.中国临床康复，2005，9(17):170

［4］刘曾旭，刘德明，王文敏，等.复方丹参对脊髓损伤大鼠一氧化氮合酶神经元的影响［J］.解剖学杂志，2004，27(4):401

［5］胡培高，孔抗美，王新家，等.复方丹参和甲基强的松龙联合治疗对大鼠急性损伤脊髓细胞凋亡及NOS表达的影响［J］.实用医学杂志，2005，21(17):1873

［6］Satake K，Matsuyama Y，Kamiya M，et al.Nitric oxide via macrophage iNOS induces apoptosis following traumatic spinal cord injury［J］.Brain Res Mol Brain Res，2000，85(1/2):114