四种中药对感染牙本质小管粪肠球菌的抑制作用

于静 胡永权 王贵花 戴东晓 李君如 谢景朝 王荣霞 赵发银

粪肠球菌（Enterococcus faecalis，E.faecalis）常见于口腔内科根管治疗失败的再感染根管中。根 管 治 疗 后 疾 病 （post－treatment endodontic disease，PED）患牙根管中粪肠球菌的感染率各学者的报道不一［1－4］，但均认为PED患牙根管中粪肠球菌为优势菌。目前，临床常用的根管消毒药物在使用中或多或少存有欠缺，因此，需要寻找一种安全有效的根管消毒药物来杀灭牙本质小管内粪肠球菌。中药具有独特的消炎、杀菌和解毒等功效，且毒副作用小。本实验选用黄连、五味子、大黄、连翘的水煎剂分别作为试验药物，以临床常用的根管消毒药甲醛甲酚 （formocresol，FC）作对照，在新鲜的离体人牙上观察其对粪肠球菌的抑制作用，以期对四种中药的抗粪肠球菌性能作初步评价，为临床进一步研究提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

黄连、五味子、大黄、连翘水煎剂［四种中药饮片各50g分别加500ml水，浸泡并经两次熬制浓缩成50ml，高压灭菌得每毫升相当于原药材1g（1∶1）的中药水煎剂，待冷却后置于4℃冰箱备用］。甲醛甲酚（FC）（武汉大学口腔医学院口腔药物材料厂，批号100525）。无菌生理盐水（石家庄四药有限公司，批号：101227407）。普通血琼脂培养基（90mm，郑州安图绿科生物工程有限公司）。

1.2 实验设备

电子分析天平（MA240D型，上海第二天平仪器厂）；全自动立式蒸汽灭菌器（Model LS－B75L－Ⅱ，江阴滨江医疗设备有限公司）；电热恒温培养箱（山东省潍坊医疗器械厂）；数字显示比浊仪（100%T，上海复星佰珞生物技术有限公司）；一次性使用细菌培养皿（直径为90mm，江苏康健医疗用品有限公司）；生物显微镜（OLYMPUS－212，日本奥林巴斯仪器公司）；15＃－40＃H型根管锉（MANI.日本）。

1.3 实验菌种

粪肠球菌（Enterococcus faecalis）临床菌株1株，石家庄市第二医院细菌室提供。

1.4 实验标本及分组

选择因正畸治疗拔除的新鲜单根管牙84颗，冷冻－20℃冰箱内保存备用。排除牙体龋坏及髓或牙根面龋者、牙根不完整或牙根未发育完全，根尖孔未完全形成或敞开及牙根表面存在细小裂纹者。84颗离体牙分别编号，根据随机数字表依次将牙齿分入阴性对照组、甲醛甲酚组、黄连水煎剂组、五味子水煎剂组、大黄水煎剂组、连翘水煎剂组、阳性对照组，共为7组，每组12颗。见表1。

表1 7组牙根根管的处理情况

1.5 实验方法

1.5.1 牙齿预备 将84颗离体牙浸泡于5.25%NaCl 0溶液，24小时后常规开髓、揭顶、去冠髓、拔髓，采取逐步后退法预备根管致40＃大小，配以5.25%NaCl 0溶液与17%EDTA溶液交替冲洗及超声荡洗。用高速金刚砂车针去除牙齿冠部及根尖部，留取6mm高的柱状牙根。将制备好的牙根置于含有25ml牛心脑浸液（BHI肉汤）的试管中，121℃高温、高压下灭菌15分钟，置于5%CO2培养箱（37℃）内，24小时后观察BHI肉汤无浑浊，以确定灭菌完全。

1.5.2 制备标准菌液 复苏并鉴定粪肠球菌，将其接种于BHI肉汤中，用比浊仪调整浊度为0.5M（透光度为80%T）的标准菌液备用。

1.5.3 建立根管感染模型 将72颗牙根置于已制备的含粪肠球菌的菌液中，置于5%CO2培养箱（37℃）内培养（以利于粪肠球菌感染根管）。24小时后取出各牙根，用无菌生理盐水荡洗根管，无菌吸潮纸尖干燥根管，用蜡将牙根固定于一次性细菌培养皿的底部（注意底部根管口封闭完全）。

1.5.4 放置根管消毒剂及检测消毒效果 用一次性无菌注射器将药剂按分组方法输送至每颗牙根的根管内（见表1）。将放置牙根的各组培养皿置于5%CO2培养箱（37℃）内培养，至第3天时每组各取出6颗牙根，去除根管内试验药物，用无菌生理盐水冲洗、无菌吸潮纸尖干燥后用慢速G钻均匀磨取根管内层牙本质粉末，用电子天平称取4mg，置于含有20ml BHI肉汤的无菌试管内，5%CO2培养箱（37℃）内培养72小时后取试管内上层液体，比浊仪测量上层液体的透光度，并记录数据。培养至第7天时取出每组剩余6颗牙根，作上述处理及检测。透光度数值接近阴性对照者，证明其抑菌效果好；反之接近阳性对照者，其抑菌效果较差。在测量透光度的同时，各组分别取少量上层液体接种于普通血琼脂培养基上，5%CO2培养箱（37℃）内培养48小时。进行快速革兰染色，生物显微镜下鉴定BHI肉汤试管内细菌的种类。镜下观察为G＋球菌，呈椭圆形，符合粪肠球菌镜下形态，无其他细菌生长。证明实验过程无污染。

1.6 数据分析

使用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。因各组数据方差不齐且非正态分布，选择秩和检验进行统计分析。P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 细菌培养3天时透光度比较

7组培养物上层液体透光度比较，差别有统计学意义（P＜0.05）。黄连水煎剂组与甲醛甲酚组牙本质小管中残留细菌量较阳性对照组均明显减少，差别有统计学意义（P＜0.05）；两者残留的细菌量最少，差别无统计学意义（P＞0.05）；连翘水煎剂组与阳性对照组比较差别无统计学意义（P＞0.05）；其余各组间差别均有统计学意义（P＜0.05）（见表2）。

2.2 细菌培养7天时透光度比较

7组培养物上层液体透光度比较，差别有统计学意义（P＜0.05）。黄连水煎剂组与甲醛甲酚组比较差别无统计学意义（P＞0.05），该两组与阴性对照组差别有统计学意义（P＜0.05），但数值很接近；与阳性对照组有差别且有统计学意义（P＜0.05）；连翘水煎剂组与阳性对照组比较差别无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组根管不同处理方法抑菌效果比较（±s，﹪）

表2 各组根管不同处理方法抑菌效果比较（±s，﹪）

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3 讨论

粪肠球菌多存在于根管充填完善但仍有持续根尖损害的根管中，是导致根管治疗失败的主要病原菌。本研究参考Haapasalo及Ørstavik的实验方法［5］将粪肠球菌植入离体牙根管内，并模拟口腔温度及厌氧环境进行培养，制备感染根管内牙本质小管的体外模型，观察临床常用根管消毒药物及四种中药的抑菌效果。本实验能比较准确的模拟口腔内环境，比较直观的反映实际情况，所得结果可信且具有一定的临床指导意义。

根管治疗步骤包括根管预备、消毒和充填，有研究发现根管经过预备后，虽然根管内细菌的数量明显减少［6］，却不能完全被杀灭。由此可见应用有效的药物消毒是很有必要的。而药物消毒的效果则主要取决于根管消毒剂。因此，本实验选用临床常用并公认消毒效果较好的甲酫甲酚作为对照组，观察黄连、五味子、大黄、连翘水煎剂对离体人牙根管内粪肠球菌的抑菌效果，使实验结果更直观、更具说服力。

为了更精确地反映中药的抑菌作用 ，笔者还选择了对肠球菌的体外抗菌活性检测有较好的抑菌效果［7－9］的六种中药（黄连、五味子、大黄、连翘、乌梅、黄芩），应用M－H琼脂进行了六种中药对粪肠球菌抑菌活性的检测，并选出其中抑菌效果较好的中药黄连、五味子、大黄、连翘进行了对感染牙本质小管粪肠球菌的抑菌实验。实验结果显示黄连水煎剂对粪肠球菌的抑菌作用优于其他参试中药，其抑菌效果与甲酫甲酚无差别，考虑与黄连的主要抑菌成分黄连素（小檗碱）有关。黄连素具有广谱抗菌作用，低浓度抑菌，高浓度杀菌。其作用机制可能是：（1）破坏细菌结构；（2）抑制细菌糖代谢，黄连能抑制酵母菌及细菌糖代谢的中间环节丙酮酸的氧化脱羧过程；（3）抑制核酸、蛋白质合成。两种实验结果的一致性进一步证明了黄连有很好的抑制粪肠球菌作用，具备成为新的根管消毒药物的潜能。且中药水煎剂制备相对简便，毒副作用小，不易产生耐药性，因此进一步将其用于临床是十分经济和安全有效的。

［1］Reynaud Af Geijersstam AH，Ellinqton MJ，Warner M，et al.Antimicrobial susceptibility and molecular analysis of Enterococcus faecalis originating from endodontic infections in Finland and Lithuania［J］.Oral Microbiol Immunol，2006，21（3）：164－168.

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［6］Pataky L，Iványi I，Grigárá，et al.Antimicrobial efficacy of various root canal preparation techniques：An in vitro comparative study［J］.J Endodon，2002，28（8）：603－605.

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［8］李仲兴，王秀华，张立志，等.应用M－H琼脂进行五倍子等5种中药对28株肠球菌的体外抗菌活性观察［J］.中草药，2001，32（12）：1101－1103.

［9］岳云升，李仲兴，王秀华，等.用新方法进行大黄对308株临床菌株抗菌活性研究［J］.航空航天医药，2004，15（1）：16－18.