(2－(4'－噻唑基)苯并咪唑)(L－丙氨酸根)铜(Ⅱ)配合物的合成、表征、抑菌活性及与DNA的作用

朱 丽，卢艳梅，区志镔，乐学义

(华南农业大学理学院，广东广州510642)

苯并咪唑衍生物具有良好的生物活性，可作为抗菌、抗病毒和杀虫剂以及抗癌药物等［1-2］，尤其是这些化合物与某些过渡金属离子结合形成配合物时可提高其生物活性，并且这种活性可能与化合物对DNA的作用有关，因此苯并咪唑衍生物金属(尤为过渡金属)配合物与DNA相互作用及其应用受到人们广泛关注［3-7］.另外，人们研究发现，当在金属配合物中插入L-α-氨基酸等生物配体时，能够增强药物对生物细胞膜的渗透作用等，从而进一步提高配合物的生物活性［8］，因此研究含L-α-氨基酸及苯并咪唑衍生物过渡金属配合物有重要意义.

本文以重要的苯并咪唑衍生物2-(4'-噻唑基)苯并咪唑(图1)作为第1配体，L-丙氨酸为第2配体，重要生命元素铜(Ⅱ)作为中心离子合成了新的三元配合物［Cu(TBZ)(L-Ala)(H2O)］ClO4［其中TBZ=2-(4'-噻唑基)苯并咪唑，L-Ala=L-丙氨酸根］(以下简称配合物).通过二倍试管稀释法研究了配合物的抑菌活性，并采用电子吸收光谱、荧光光谱、圆二色光谱、粘度测定及琼脂凝胶电泳等方法研究了该配合物与DNA的相互作用，为研制新型高效抗菌剂提供科学依据.

图1 2-(4'-噻唑基)苯并咪唑的分子结构式Fig.1 Molecular structure of 2-(4'-thiazolyl)benzimidazole

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Vario EL元素分析仪(ELEMENTAR公司);ACATAR 360 FT-IR型红外光谱仪(美国Nicolet公司);Shimadzu UV-2550型紫外/可见分光光度计(日本Shimadzu公司);DDS-12A型电导率仪(上海宇隆仪器有限公司);F-4500荧光光谱仪(日本HITACHI公司);JASCO-810型圆二色光谱仪(日本JASCO公司);乌氏粘度计(上海晶菱玻璃有限公司);BIORAD凝胶成像系统(BIO-RAD Laboratories-Segrate意大利米兰).

2-(4'-噻唑基)苯并咪唑、L-丙氨酸、小牛胸腺DNA(CT-DNA)、溴化乙啶(EB)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、抗坏血酸(Vit C)、琼脂糖凝胶和质粒pBR322DNA均为生化试剂，其他试剂为市售分析纯.研究配合物与DNA相互作用时，底液Tris-HCl/NaCl缓冲溶液为:10 mmol·L-1Tris+50 mmol·L-1NaCl缓冲液(pH=7.2)，Tris-硼酸(TBE)电泳缓冲液为:4.5×10-2mol·L-1Tris+4.5×10-2mol·L-1H3BO3+1 mol·L-1EDTA(pH=8.3)，CT-DNA 浓度按照文献［9］方法确定.

供试菌种:金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(G+)，枯草杆菌Bacillus subtilis(G+)，沙门氏杆菌Salmonella typhi(G-)，大肠埃希菌 Escherichia coil(G-)由华南农业大学农学院广东省植物分子育种重点实验室提供.

1.2 配合物的合成与表征

称取0.5 mmol丙氨酸溶于5 mL双蒸水中并用0.5 mmol NaOH中和搅拌得溶液A;将0.5 mmol TBZ溶于20 mL无水乙醇中，加热搅拌下加入1.0 mL 0.5 mol·L-1Cu(ClO4)2溶液，反应 15 min，得溶液B;将以上2种溶液混合，待加热搅拌回流30 min后冷却至室温，过滤，静置滤液，15 d后析出蓝色晶体.过滤并依次用少量水、乙醇洗涤，空气中干燥后置于干燥器中保存.通过KBr压片测定配合物在400～4 000 cm-1范围内的红外光谱，测定配合物甲醇溶液的电子吸收光谱，以及对配合物进行元素分析，从而对配合物的结构进行表征.

1.3 抑菌试验

应用试管二倍稀释法测定配合物最小抑菌浓度(MIC).取10支(10 mL)消毒试管并进行编号.首先往10支消毒并已编号的试管(10 mL)中分别加入1.0 mL营养肉汤，然后将1.0 mL待测样品加入到1号试管内，振荡摇匀后，从1号试管吸取1.0 mL溶液加入到2号试管，再从2号试管吸取1.0 mL溶液加入到3号试管，一直到9号试管，再从9号试管内吸取1.0 mL溶液弃去.10号试管不加待测样品.在10支试管中均加入20 μL菌液，然后将10支试管放入培养箱，在相对湿度＞80%和温度为37℃条件下培养24 h后取出观察，并记录试验现象.

1.4 配合物与CT-DNA作用

1.4.1 电子吸收光谱测定 以Tris-HCl/NaCl缓冲溶液作空白对照液，测定标题配合物在200～400 nm范围内的电子吸收光谱.然后，在恒定配合物浓度为1×10-4mmol·L-1下，依次往空白池和样品池中加入等体积的CT-DNA溶液，使CT-DNA与配合物的浓度比值不断增加，室温下作用6 min后，在相同波长范围内扫描.

1.4.2 荧光光谱测定 以Tris-HCl/NaCl缓冲溶液作溶剂，配制 EB 浓度为4.8 μmol·L-1、CT-DNA 浓度为5.5 μmol·L-1的溶液，放置4 h后测定该体系的荧光强度.然后，保持EB和CT-DNA浓度不变，逐渐增加配合物的浓度，室温下作用5 min后，在同样波长范围内扫描.仪器测量参数:激发波长为525 nm，扫描速度为240 nm·s-1，波长范围为550～650 nm.

1.4.3 圆二色光谱测定 固定CT-DNA浓度为100 μmol·L-1，逐渐增加配合物浓度，在同样波长范围内，测定其圆二色(CD)光谱.扫描速度 100 nm·min-1，波长范围200～320 nm，累计扫描5次.

1.4.4 粘度试验 恒定温度为(29.0±0.1)℃，以Tris-HCl/NaCl缓冲溶液作为溶剂，固定CT-DNA浓度为0.2 mmol·L-1，依次增大配合物浓度，并测定溶液流经毛细管的时间.由公式η=(t-t0)/t0(式中，t0为缓冲溶液流经毛细管所需时间，t为含不同浓度配合物的CT-DNA溶液流经毛细管所需的时间)计算CT-DNA溶液相对粘度(η)，然后以(η/η0)1/3对c配合物/cDNA(η0为未加配合物时CT-DNA溶液的比粘度)作图.每个样品溶液至少重复测定3次，取平均值.

1.5 配合物对pBR322DNA的切割作用

固定pBR322 DNA为200 ng，逐渐增加配合物的浓度及50倍于配合物浓度的还原剂Vit C，然后用Tris-HCl/NaCl缓冲溶液定容至17 μL，28℃下放置2 h后，加入3 μL上样缓冲液［含0.25%(w)溴酚蓝和50%(w)甘油的水溶液］，在8 g·L-1琼脂糖凝胶和TBE电泳缓冲液中电泳(100 V)40 min.溴酚蓝作为电泳过程指示剂，Gold View(4～5 μL)作为凝胶着色剂，电泳结果在凝胶成像分析系统上照相.为了探索配合物切割DNA的作用机理，在上述相同条件下，先分别将 4 μL 二甲基亚砜(DMSO)、100 μmol·L-12，2，6，6-四甲基 -4- 哌啶酮(TMP)或叠氮钠(NaN3)与pBR322 DNA混合作用15 min，再加入配合物及Vit C，进行电泳和照相.

2 结果与分析

2.1 配合物表征

配合物 C15H21O8N4CuS2Cl元素分析，实验值/%:C，33.31;H，3.19;N，11.85;理论值/%:C，33.20;H，3.21;N，11.91.元素分析结果与理论值基本吻合，表明推测的配合物组成与实际一致.测得配合物甲醇溶液的摩尔电导率为115 S·cm2·mol-1，由此推测配合物为1∶1型电解质［10］.

测得配合物红外光谱 (KBr)，ν/cm-1:3 443(s，br)，3 267(m)，3 059(m)，1 647(vs)，1 391(s)，1 521(w).3 443 cm-1处强的吸收峰归属于配位H2O的ν—OH;3 059 cm-1及3 267 cm-1处吸收带归属于—NH2的2个不对称分裂吸收峰ν—NH，表明L-丙氨酸根的—NH2参与了配位;1 647 cm-1及1 391 cm-1分别归属于—COO-的不对称伸缩振动νasCOO-和对称伸缩振动，且之间差值:△ν()＞200 cm-1，表明 L-Ala的—COO-为单齿配位基团［11］.另外，1 521 cm-1处吸收归属于配体 TBZ 的C ═ N伸缩振动.

试验测得配合物电子吸收光谱，λ/nm(ε/(L·mol-1·cm-1)):243(15 241)，301(19 798)，633(132).在配合物甲醇溶液的电子光谱中，紫外区243 nm和251 nm处2个强吸收峰均归属于配体TBZ的π→π*跃迁.与自由配体相比，最大吸收峰的位置未发生明显改变，但强度有所减弱，归因于TBZ上的氮原子配位后引起配体芳环上电子云密度的降低.另外，633 nm处弱而宽的吸收峰归属于中心Cu(Ⅱ)离子的d→d跃迁，并由此推测配合物在甲醇溶液中具有变形四方锥结构.

综合上述分析可以推测，标题配合物分子式为:［Cu(TBZ)(L-Ala)(H2O)］ClO4.

2.2 配合物抑菌活性

将化合物配制成质量浓度为1 024及640 μg·mL-1的原液，通过试管二倍稀释法形成浓度梯度.细菌最终接种量为5×106CFU·mL-1，37℃条件下培养24 h，测得Cu(ClO4)2、TBZ和配合物抑制细菌最低质量浓度(MIC)，结果见表1.

表1 化合物抑制细菌生长的最低质量浓度(MIC)Tab.1 Minimal inhibitory concentrations(MIC)of the compounds for the assayed bacteria μg·mL-1

表1中试验数据表明:对于所有4种菌种，配合物所需最低抑菌浓度均比Cu(ClO4)2和TBZ的低，表明配合物抗菌活性高于Cu(ClO4)2及TBZ，这可能主要归因于配合物分子中中心金属铜(Ⅱ)离子与配体之间的协同作用，与文献［4］报道的结论一致.

2.3 配合物与CT-DNA的相互作用

为了初步探索配合物抑菌作用机理，本文通过光谱学、流体力学等方法研究了配合物与DNA的作用.

2.3.1 电子吸收光谱 电子吸收光谱是研究配合物与DNA作用的最常用方法之一.在210～400 nm范围内，标题配合物均出现了2个吸收峰，归属于2-(4'-噻唑基)苯并咪唑的π→π*跃迁吸收.配合物与CT-DNA相互作用的吸收光谱滴定曲线如图2所示.图2表明，配合物在210～400 nm波长范围内吸收峰强度随着CT-DNA浓度增加而发生明显的减色效应，说明配合物与CT-DNA之间可能发生了插入作用，并根据以下方程式可定量求得两者间的结合常数 Kb［12］:

其中，cDNA为 CT-DNA的浓度，εa为配合物的表观摩尔吸光系数，εf和εb分别为自由配合物的摩尔吸光系数和完全结合后的配合物的摩尔吸光系数.以cDNA/(εf-εa)对 cDNA作图(图 2 中插图)，由斜率与截距的比值获得结合常数 Kb=1.439×105L·mol-1，此值比经典插入试剂溴乙锭(EB)的Kb值(1.4 ×106L·mol-1)［8］小1 个数量级，表明标题配合物对DNA的插入作用较弱.

图2 配合物在不同CT-DNA浓度下的电子吸收光谱图Fig.2 Absorption spectra of the complex upon addition of CTDNA

2.3.2 荧光光谱 荧光光谱被广泛地应用于研究配合物与DNA之间的相互作用.测得配合物与CTDNA作用的溴化乙锭(EB)荧光光谱如图3所示.

图3 配合物对EB-DNA体系荧光光谱的影响Fig.3 Effects of the complex on the fluorescence spectra of EBDNA system

由图3可以看出，随着配合物浓度增加，EB-CTDNA体系的荧光强度被显著地淬灭，表明配合物分子将EB从EB-CT-DNA复合物中挤出，由此推测配合物可能对CT-DNA发生了插入作用.由以上滴定试验，应用经典Stern-Volmer方程可以求得配合物取代EB而与CT-DNA作用的淬灭常数Ksq［12］:

其中，I0和I分别为未滴加配合物和滴加配合物时EB-CT-DNA体系的荧光强度，r为配合物与CT-DNA的浓度比.将I0/I对r作图获得一条直线(图3中插图)，其斜率为Ksq值，即0.088 43.此值比文献报道的配合物的Ksq值［13］小得多，表明配合物对CT-DNA只有较弱的插入作用，与以上电子吸收光谱研究结果一致.

2.3.3 圆二色光谱 DNA是手性大分子，CD光谱中有2个特征的吸收峰，即275 nm附近的正峰和245 nm附近的负峰.当配合物与DNA作用，尤其是插入到DNA碱基对之间时，DNA构象会发生变化，从而引起DNA的CD光谱发生变化［14］.因此，CD光谱是研究配合物与DNA相互作用的重要方法.标题配合物与CT-DNA相互作用的CD光谱如图4所示.

图4 配合物对CT-DNA圆二色光谱的影响Fig.4 Effects of the complex on CD spectra of CT-DNA

由图4可以看出，CT-DNA的正、负CD峰均随着配合物浓度增大而减弱，表明配合物与CT-DNA之间发生了作用，并且这种作用可能与配合物对CTDNA的插入作用有关.

2.3.4 粘度测定 粘度测定被认为是在缺乏晶体结构数据情况下确定配合物与DNA作用模式的重要手段之一［15］.当配合物以静电、沟面结合等非插入方式与DNA作用时，DNA溶液的粘度无明显变化;以部分插入方式与DNA作用时，会导致DNA双螺旋扭结，DNA溶液的粘度降低;而以插入方式与DNA作用时，会导致DNA双螺旋伸长，DNA溶液的粘度增加.配合物对CT-DNA相对比粘度的影响如图5所示.

图5 配合物对CT-DNA相对比粘度的影响Fig.5 Effects of the complex on the relative viscosity of CT-DNA

结果表明，随着配合物浓度增大，CT-DNA溶液的相对比粘度增加，由此推测配合物以插入方式与CT-DNA作用［15］，与上述光谱方法得出的结论一致.

2.4 配合物对pBR322 DNA的切割作用

琼脂糖凝胶电泳是研究配合物对DNA切割作用的重要方法.pBR322 DNA有3种构型，即共价闭环超螺旋型(Ⅰ型)、缺刻环形(Ⅱ型)以及线型(Ⅲ型).这3种pBR322 DNA构型在电泳过程中具有不同的迁移速率，通常Ⅰ型结构最为紧密，迁移速率最大，Ⅲ型次之，而Ⅱ型结构比较松散，迁移速率最小.28℃条件下，测得配合物对pBR322 DNA的切割作用如图6所示.

图6 配合物切割pBR322 DNA的凝胶电泳图Fig.6 Agarose gel eletrophoresis for the cleavage of pBR322 DNA by the complex in the presence of Vit C

图6表明，抗坏血酸、配合物或在抗坏血酸存在下，Cu(ClO4)2及TBZ对pBR322 DNA均未显示出明显的切割作用，只有配合物与抗坏血酸共存条件下才能将pBR322 DNA的超螺旋构型切割成缺刻构型.

为了进一步揭示配合物切割DNA的作用机制，在活性氧·OH自由基清除剂二甲基亚砜(DMSO)及单线态氧1O2清除剂2，2，6，6-四甲基-4-哌啶酮(TMP)或叠氮钠(NaN3)存在下，研究了配合物对pBR322 DNA的切割作用(图7).

图7 加入抑制剂后配合物切割pBR322 DNA的凝胶电泳图Fig.7 Cleavage of pBR322 DNA in the presence of the complex and inhibitor DMSO，TMP，or NaN3

由图7可见，在加入DMSO(第3泳道)、TMP(第4泳道)或 NaN3(第 5泳道)后，配合物对pBR322 DNA的切割能力减弱，即 DMSO、TMP或NaN3对配合物切割DNA有抑制作用.由此推测配合物对pBR322 DNA的切割作用可能与羟基自由基·OH，单线态氧1O2或者单线态氧1O2类似物有关［16］.

3 讨论与结论

本文合成和表征了新的三元配合物:［Cu(TBZ)(L-Ala)(H2O)］ClO4，并研究了该配合物的抑菌活性及与DNA的作用.该配合物分子与文献［8］报道的配合物［Cu(phen)(L-Thr)(H2O)］(ClO4)类似，具有变形四方锥配位结构，并以插入方式与DNA作用.但与［Cu(phen)(L-Thr)(H2O)］(ClO4)不同的是，在Vit C存在下，该配合物切割DNA既与羟基自由基·OH有关，又可能与单线态氧1O2或其类似物有关.与配体TBZ及铜(Ⅱ)盐Cu(ClO4)2相比，该配合物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、沙门氏杆菌和大肠埃希菌等具有良好的抑制作用，这既与中心铜(Ⅱ)离子与芳香杂环配体TBZ的π-协同作用有关，又可能依赖于药物分子中插入了L-丙氨酸，因为L-α-氨基酸配体能够增强药物分子对生物细胞膜的渗透作用、减弱其在生物体内毒副性、提高水溶性而增强细胞对药物吸收效果等，从而可进一步提高配合物的抗菌活性.另外，该配合物抗菌活性可能与配合物对生物体内DNA的抑制作用有关，有关详细作用机制有待于进一步研究.

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