马铃薯种质离体保存技术

岳新丽，湛润生，帅媛媛，陈 云

（1.山西省农业科学院高寒区作物研究所，山西 大同 037008；2.大同大学农学与生命科学学院，山西 大同 037009）

近年来，植物种质资源流失的情况越来越严重，植物种质资源保存已成为全球性关注的课题[1]。缓慢生长离体保存被证明是行之有效的种质保存方法，以组织培养技术为基础，通过改变培养物生长的外界环境条件，使细胞生长降至最小限度，以延长继代间隔时间，减少继代次数，实现植物种质资源的中长期保存目的[2]，此法已经成功地应用于多种植物[3-4]。本文以马铃薯无菌苗为外植体，以MS为基本培养基，研究了蔗糖、多效唑（PP333）在常温和低温条件下对马铃薯试管苗离体保存的影响，以期为马铃薯种质资源的离体保存提供技术支持和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以山西省农业科学院高寒区作物研究所育成的新品种‘晋薯16号’无菌苗为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 预培养

取整齐一致的马铃薯节间作为外植体，以MS+IAA 0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L为基本培养基，在温度25±1℃、光照时间为14h/d、光照强度1600～3000 lx条件下进行增值扩繁以备用。

1.2.2 蔗糖对马铃薯试管苗常温保存的影响

以MS+IAA 0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L为基本培养基，在培养基中分别添加蔗糖浓度10、30、50、70、90、110 g/L共6个试验处理，对马铃薯试管苗进行保存。

1.2.3 PP333对马铃薯试管苗常温保存的影响

以MS+蔗糖30g/L+IAA0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L为基本培养基，在培养基中添加不同PP333浓度0、0.5、1.0、1.5、3.0 mg/L共5个试验处理，对马铃薯试管苗进行保存。

1.2.4 PP333对马铃薯试管苗低温保存的影响

先将各处理的马铃薯试管苗在常规条件下培养10 d，再转入4℃低温冰箱里避光保存，培养基同1.2.3。

每试验处理接种10瓶，每瓶接种5株马铃薯无菌苗，共3次重复。试验材料为剪取1～1.5 cm长带叶茎段，插入培养基中进行离体保存试验。培养温度25±1℃、光照时间为14 h/d、光照强度为1000～1500 lx。连续培养保存150 d，每隔1个月检查1次并且观察记录其生长分化情况和保存存活率。

1.2.5 恢复生长

将经过离体保存后的马铃薯试管苗与1个月继代1次正常培养的试管苗同时接种到继代培养基中（MS+蔗糖30 g/L+IAA0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L），增殖培养30 d后统计试管苗的高度，生长情况。本试验均为单因子试验，各处理抽取5瓶掏出苗子洗净根部培养基，随机抽取5株，3次重复，数据取其平均值。方差分析采用邓肯新复极差法。

2 结果与分析

2.1 蔗糖对马铃薯试管苗常温保存的影响

由图1看出，10～50 g/L范围的蔗糖处理马铃薯试管苗时，对试管苗的生长没有起到抑制作用，当保存时间到150 d时，保存的马铃薯试管苗枯黄死亡，茎变细，根细长发黄，培养基呈黑色。蔗糖浓度在50 g/L的培养基与正常蔗糖含量以及低浓度蔗糖（10 g/L）的培养基相比，对试管苗没有抑制作用，但植株茎秆、根系粗壮，叶色深绿。但70～110 g/L范围的蔗糖处理时，对试管苗生长的抑制作用明显。添加70 g/L和90 g/L蔗糖保存150 d后，试管苗较对照健壮，叶色绿，培养基无明显变化，存活率为70.7%和87.3%，而110 g/L蔗糖的浓度过高，抑制作用过于强烈，致使试管苗的存活率下降至56.3%，保存期缩短。因此有利于保存马铃薯试管苗的蔗糖浓度是90 g/L。

图1 不同浓度蔗糖对马铃薯试管苗常温保存的影响Figure1 Effect of different concentrations of sucrose on preservation of tube-plantlets at room temperature

2.2 PP333对马铃薯试管苗常温保存的影响

从图2可以看出，不添加PP333的马铃薯试管苗120 d后全部死亡，而经过PP333处理后，其成活率显著提高。从总体上来看生长延缓剂PP333对马铃薯试管苗的保存是具有抑制生长的作用，浓度对试管苗保存的效果影响较大，低浓度的PP333可以促进马铃薯试管苗的健壮生长，其茎秆粗壮，根系发达，分枝增多，但保存的时间有限；高浓度的PP333使试管苗生长缓慢，茎秆粗壮矮小，但试管苗的叶片数目增加，颜色加深，根变粗短而根数减少，并出现大量的丛生芽。当生长延缓剂PP333浓度为1.0 mg/L，试管苗保存的效果最好，连续保存5个月还有93%的试管苗存活；PP333浓度为1.5 mg/L和0.5 mg/L的处理次之，试管苗的存活率分别为74%、54%。当浓度比较大幅度提高到3.0 mg/L，对试管苗表现出毒害作用，死苗现象严重，保存存活率随着时间的延长而快速下降。综合分析认为，生长延缓剂PP333在马铃薯试管苗保存中应用的适宜处理浓度为1.0 mg/L。

图2 不同浓度PP333对马铃薯试管苗常温保存的影响Figure2 Effect of different concentrations of PP333 on of preservation of tube-plantlets at room temperature

2.3 PP333对马铃薯试管苗低温保存的影响

从图3可以看出，4℃的低温能显著延长所有不同 PP333浓度处理的马铃薯试管苗的离体保存时间。在低温下，对照虽然没有加入PP333，但由于低温的作用，其保存时间也比常温保存的时间要长，至150 d时还有30.3%的成活率；在低温下，低浓度的 PP333有利于提高试管苗的成活率，而高浓度的PP333则可对试管苗产生毒害，使其成活率下降，马铃薯试管苗低温下保存的最佳PP333浓度为0.5 mg/L，低于常温保存时的最佳浓度。可见，PP333对马铃薯试管苗的低温保存效果优于常温保存。

图3 不同浓度PP333对马铃薯试管苗低温（4℃）保存的影响Figure3 Effect of different concentrations of PP333 on preservation of tube-plantlets at low temperature(4℃)

2.4 保存马铃薯试管苗的恢复生长

选马铃薯离体保存试管苗各处理的最佳浓度进行继代培养。从表1可以看出，马铃薯试管苗经保存处理后再生苗与对照常温继代苗在株高、茎粗、根的数量等方面差异不显著，即对试管苗继代生长没有影响。说明蔗糖、PP333用来保存马铃薯种质是合适的，能够保证遗传资源的稳定性。

表1 马铃薯离体保存后再生苗与继代苗形态指标的比较Table1 Morphological index of in vitro preservation regenerated plantlets and subculture plantlets

3 讨论

本试验在培养基中添加低浓度的蔗糖对马铃薯的生长没有抑制作用，当蔗糖浓度提高至70 g/L时，有效抑制了马铃薯的生长。这是由于提高蔗糖浓度，使培养基的渗透压超过了其承受范围，使水分、养分吸收受阻，从而抑制了生长。

本试验证明，在马铃薯的离体保存中，PP333的使用可以减缓试管苗的生长速度，延缓继代时间，从而能显著提高马铃薯试管苗常、低温保存的成活率，PP333浓度过高则容易产生毒害作用，成活率反而降低。这与PP333对草莓[5]的保存效果一致。

在试管苗离体保存中，低温对试管苗生长有明显的抑制作用，低温下的成活率明显高于常温条件。因此，低温处理是试管苗保存的常用方法[6]。本试验表明，在常温25℃条件下，马铃薯试管苗保存150 d后成活率显著低于4℃条件下试管苗的成活率。这与地黄[7]的低温保存效果一致。

[1]巩振辉,申书兴.植物组织培养[M].北京:化学工业出版社,2007:178-189.

[2]陈辉,陈晓玲,陈龙清,等.百合种质资源限制生长法保存研究[J].园艺学报,2006,33(4):789-793.

[3]赵海红,贝丽霞,丁俊杰.不同生长延缓剂对马铃薯脱毒试管苗保存的影响[J].黑龙江农业科学,2010(5):1-2.

[4]王艳芳,房伟民,陈发棣,等.‘神马’菊花的离体保存及遗传稳定性[J].西北植物学报,2007,27(7):1341-1348.

[5]赵密珍,刁曼妮,钱亚明,等.多效唑对草莓种质离体保存的影响[J].植物遗传资源学报,2003,4(3):242-244.

[6]Yin M H. Cryopreservation of Dendrobium candidum Wall.ex Lindl.protocorm-like bodies by encapsulation-vitrification[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2009,98(2):179-185.

[7]温学森,魏建和,杨世林,等.地黄种质资源的离体保存研究[J].中国中药杂志,2003,28(1):17-20.