细胞命运的逆转:体细胞核移植与诱导多能干细胞——2012年诺贝尔生理学或医学奖简介

汪 璇 王晓民

(首都医科大学神经生物学系，教育部神经变性病重点实验室，北京脑重大疾病研究院，北京 100069)

2012年10月8日，位于瑞典卡罗林斯卡研究院的诺贝尔奖委员会宣布将2012年诺贝尔生理学或医学奖共同授予John B.Gurdon(约翰·伯特兰·戈登)和Shinya Yamanaka(山中伸弥)两位科学家，以表彰他们在“成熟细胞可重编程而具有多能性”方面的重大发现。评委们认为，这两位科学家发现成熟分化的细胞可以重新编写发育程序，逆转回归成为能够发育成机体各种组织的未成熟细胞。这一使细胞命运发生逆转的发现颠覆了传统意义上对于细胞或生物体发育程序的固有观念。

尽管John B.Gurdon和Shinya Yamanaka两位科学家在接到获奖电话通知时都表现出异常惊讶和兴奋的情绪，但他们的获奖其实早有端倪。2009年，两位科学家就曾分享有“美国诺贝尔奖”之称的Albert Lasker基础医学奖;一些科学家也曾预言他们是近几年诺贝尔生理学或医学奖最热门的人选。

1 获奖者简介

1.1 John B.Gurdon

John B.Gurdon(图1)，英国发育生物学家，1933年10月2日出生在英国萨里郡韦弗利地区一个称作Dippenhall的小村庄。1960年Gurdon在英国牛津大学获得博士学位，随后到美国加州理工学院从事博士后研究。1962年他返回英国，就职于牛津大学动物学系，直至1972年进入英国剑桥大学分子生物学系及后来的动物学系工作;曾任剑桥麦格达伦学院院长。1989年他参与创办旨在资助细胞生物学和癌症研究的剑桥(后成为英国)维康信托(Wellcom Trust)研究所，并任主席至2001年。2004年该研究所更名为Gurdon研究所;目前79岁的Gurdon仍工作于Gurdon研究所。1995年Gurdon曾被英国皇室授予爵位，因此他的名字也常写成Sir John B.Gurdon。

图1 John B.Gurdon(引自诺贝尔奖官方网站)

青少年时期的Gurdon曾在伊顿学院读书，那时他的生物学成绩很差，至今他仍可清晰地记得当时老师对他“成为一名科学家的想法非常荒谬”的评语，以至于Gurdon毕业后没能直接步入科学的殿堂，而选择了英国古典文学作为他的专业。但Gurdon并没有因此放弃他的梦想，在牛津大学基督学院就读时他获准转念动物学。1962年，Gurdon发表了关于体细胞核移植的重要论文［1］，证实成熟体细胞的基因组仍携带向正常生物体发育所需的全部信息，从而开启了人类对于细胞发育程序和命运逆转的思考。值得注意的是，这项突破性的研究始于1958年，那时的Gurdon还仅仅是一名在牛津大学攻读学位的博士生，他大胆挑战“成熟细胞不可逆转发育命运”的理论，设想成熟体细胞的细胞核仍具有重启细胞发育的多能性。这个现在逐渐被公众接受、并早已被写进教科书的理论，在当时却受到了来自包括权威科学家在内的多数人的强烈质疑。几位发育学领域的权威得出了与Gurdon相反的结论，这给怀疑者们更加充分的理由，他们认为，相对于学界大师的实验结果而言，一个研究生的“谬论”不值一提，他的数据一定是错误的。回忆起当年穿着随意的毛衫，匆忙从实验室赶赴面对全世界媒体的情景，Gurdon爵士在诺贝尔奖颁奖后的电话采访中不无感慨道:“这就是科学研究的规律，一些新奇的发现总是需要先被沉淀下来，经过长期的论证再决定它们是否正确”。今年诺贝尔奖的颁布距离1962年Gurdon发表的那篇文章已长达50年之久。

1.2 Shinya Yamanaka

Shinya Yamanaka(图2)，日本医学家，1962年9月4日出生于日本大阪府东大阪市。1987年，Yamanaka在神户大学获得医学学位，开始在国立大阪医院做整形外科实习医生;但由于觉得自己缺乏成为一名外科医生的天才，最终决定转做基础研究。1993年在大阪市立大学医学院获得博士学位后，Yamanaka于1993～1996年在美国加州大学旧金山分校的Gladstone心血管疾病研究所从事博士后工作，随后就职于大阪市立大学医学院及日本奈良科技研究院。目前是日本京都大学诱导多能干细胞研究和应用中心(Center for iPS Cell Research and Application，Ci-RA)主任、Gladstone研究所高级研究员、国际干细胞联合会(International Society for Stem Cell Research，ISSCR)的现任理事长。

图2 Shinya Yamanaka(引自诺贝尔奖官方网站)

Yamanaka现年50岁，他出生的时间刚好是在Gurdon发表重要文献的同一年(1962年)。因此，获奖后的Yamanaka在提及这一时间上的巧合时，感到能与他敬重的Gurdon爵士一起分享2012年诺贝尔生理学或医学奖是无比荣耀的事情。他认为，当初对于诱导多能干细胞的探索研究正是基于50年前Gurdon的实验和理论之上。如果没有Gurdon关于“成熟细胞遗传物质具有多能性”的论述，也就不存在Yamanaka后来对于何种因子能够决定细胞重编程从而逆转发育过程的热衷筛选。2006年，Yamanaka及其合作者经过了“接力式”的漫长寻找后，最终应用4种转录因子逆转了细胞发育的进程，使成熟体细胞重新编程变为具有多能性的未成熟细胞，这一发现随即被认为是发育研究的重大突破，这篇2006年发表在Cell上的论文［2］至今已被引用6000余次。凭此项成就及后来的研究，Yamanaka近年来获得许多科学奖项和荣誉，包括与Gurdon分享的Albert Lasker基础医学奖(2009);Wolf医学奖(2011);千年科技奖(2012);McEwen创新奖(2011);Gairdner国际奖(2009);邵逸夫奖(2008);Robert Koch奖(2008)等。2012年，Yamanaka当选为美国国家科学院院士。

虽然科学认识上的巨大突破尚不能带来既得的临床应用价值，但以外科医生开始职业生涯的Yamanaka教授始终认为自己肩负着医生救治病患的天职。他在诺贝尔奖颁奖后的电话采访中谈到了他人生奋斗的目标:“我将尽我毕生的精力引领干细胞技术从实验室走向临床，使患者受益”。

2 主要科学贡献［3］

胚胎发育早期的未成熟细胞具有形成机体各种组织细胞、并进一步发育成具有成熟个体的多能特性，这些未成熟细胞被称为干细胞(stem cells)。随着发育的进程，干细胞逐渐特化成能够执行特定生理功能的各种组织细胞，如肌肉细胞、神经细胞、表皮细胞等。但与此同时，也是在这一功能特化的过程中，干细胞的分化潜能逐渐受限，多数细胞最后只能产生某一类型的组织细胞，而不再能分化出其他细胞种类，即失去了多能性。在成体某些部位，如骨髓、皮肤、中枢的嗅球和海马等，虽然还存留有潜能受限的干细胞，但大部分体细胞都将进行完全的成熟分化。分化细胞的状态十分稳定，以至于长久以来人们认为，从未成熟细胞向特化细胞发育的过程是单向的，细胞在成熟过程中发生循序的变化，它们一般不会转分化(transdifferentiation)为其他类型的细胞或者逆转回原始的多能状态;利用外界的干预策略也很难逆转细胞发育的命运。

2.1 体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)

尽管成熟细胞发育程序不可逆转的观念根深蒂固，但总有一些科学家“异想天开”，试图寻找将成熟细胞从终末分化的状态解锁，并使其逆转回具有多能性的原始细胞的方法。1935年诺贝尔生理学或医学奖获得者，德国科学家Han Spemann就曾在1938年提出细胞核移植的奇妙设想，即把分化细胞的细胞核转移到一个去核的卵细胞中，以分析这个分化细胞核的发育潜能。1952年，两位美国科学家Rober Briggs和Thomas King使Spemann的设想得以实现［4］。他们利用一种两栖类动物—豹蛙，分别从其胚胎早期的未分化细胞和胚胎后期的分化细胞中取出细胞核，将它们转移到去核的受精卵中。结果显示，接受胚胎早期细胞核转移的卵细胞最终发育出成体;而分化细胞的核移植则不能重启卵细胞的发育进程。由此得出结论，分化细胞的细胞核已失去启动发育的多能特性［5］。

1958年，为了验证与上述“分化细胞核不具发育潜能”的结论不同的假设，牛津大学博士生John B.Gurdon选择了另一种两栖类动物—非洲爪蟾蜍进行核移植实验(图3)。今天，我们可能还清楚记得《细胞生物学》教科书中对这个经典的体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)实验的描述:通过紫外线照射去掉卵细胞的核;取出成熟分化的肠上皮细胞的细胞核，将其转移到去核的卵细胞中;核的进入刺激卵细胞开始分裂，并启动卵细胞的发育进程;最终这个卵细胞发育产出子代。Gurdon发现这些蝌蚪逐渐长大，且有少数蝌蚪具有正常功能特性，因此他认为这足以说明经历了体细胞核移植的动物确实能够发育成正常个体。Gurdon也在研究中改进了Briggs和King的核移植技术，通过连续注射，细胞核重编程的效率得到较大改善。Gurdon的结论是，分化体细胞的细胞核仍具有逆转回多能特性的潜力，当将其移植到卵细胞中时，可启动发育进程，产生全部的体细胞类型。

Gurdon的实验首次证实，成熟分化的体细胞基因组仍携带向所有细胞分化的指令信息。这一发现开辟了一个新的研究领域，找到了研究受精卵发育全过程的突破口，具有重要的科学价值。应用体细胞核移植技术，从发育早期阶段入手，就可以对细胞的重编程规律、细胞分化过程中的变化等问题进行系统、深入的研究，从而为揭示人类疾病的发病机制提供重要指导。但由于随后的一些体细胞核移植实验失败，以及始终无法在哺乳动物上复制出体细胞核移植产生的成体子代，因此Gurdon这一重大突破的学术价值多年来没有获得科学界的广泛认可。直到1997年，Ian Wilmut等在Gurdon非洲爪蟾蜍工作基础上，通过体细胞核移植技术将成体绵羊乳腺上皮细胞的细胞核转移到去核的卵细胞中，产生出世界上第一例体细胞核克隆的哺乳动物—Dolly羊［6］，才对Gurdon的结论给予了有力支持，使他成为后来各种生物克隆实验的奠基人。随着克隆羊的出现，体细胞核移植技术现已被用于包括小鼠、牛、猪、狗、山羊、狼、非洲野猫等大量哺乳动物物种的克隆。遗憾的是，至今仍没有获得人源体细胞核移植产生的原始多能干细胞。

图3 Gurdon和Yamanaka的主要科学贡献及价值(引自诺贝尔奖官方网站)

2.2 诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)

体细胞核移植实验需将细胞核取出，并进一步注射到去核的卵细胞中。这一过程步骤繁琐，技术要求高超。若对细胞不加任何处理，即无需去核、取核和核移植，应用简单的分子生物学技术，就能将成熟分化的体细胞完全诱导逆转回归成未成熟的多能状态，这似乎更加不可思议。2006年，也就是在Gurdon进行体细胞核移植和细胞重编程实验的44年后，Shinya Yamanaka在小鼠体内破译了将体细胞重编程使其逆转回原始干细胞的过程，这些重新编写了发育程序、具有向机体各种细胞分化能力的未成熟细胞被Yamanaka命名为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)。

iPS细胞的实验始于对胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES cells)的研究。ES细胞来源于囊胚期的内细胞团(inner cell mass)，具有分化出3个胚层、各种体细胞的多能特性。1998年，人ES细胞在体外培养成功［7］，进而掀起了干细胞研究浪潮，Yamanaka也是其中的追随者之一。但ES细胞可能会涉及到使用人类胚胎的伦理问题以及移植后的免疫排斥问题;Yamanaka也意识到ES细胞的局限性。故当人们对ES细胞的研究如火如荼之际，Yamanaka另辟蹊径，他参考了Gurdon、Wilmut等前辈在体细胞核重编程方面的研究，设想一些维持ES细胞多能性的因子极有可能会诱导体细胞具有多能性，于是他开始尝试寻找在ES细胞中特异表达或发挥关键作用的转录因子［8］。到2004年的时候，Yamanaka带领他的团队共获得24个可能诱导多能性的候选因子，并将它们全部一次性导入小鼠皮肤的成纤维细胞，发现一些成纤维细胞确实呈现出与ES细胞非常相似的克隆形态、增殖能力和部分特异基因的表达(图3)。之后，导入的基因数目逐个减少，最终确定仅用4种转录因子 c-Myc、Oct3/4、Sox2和Klf4的组合就足可诱导成纤维细胞转变为iPS细胞，其中Oct3/4的作用最为重要。这些细胞在裸鼠体内分化出含有来自3个胚层不同种类细胞的畸胎瘤，显示了其多能性。2007年，Yamanaka应用这4个因子成功诱导出人iPS细胞［9］;在另一篇报道中［10］应用 Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28 的组合也诱导出人iPS细胞。这些人iPS细胞与人ES细胞在形态、基因表达及多能细胞特异基因的表观遗传学(epigenetics)性状上都非常相似，它们能够在体外分化出3个胚层的多种细胞类型，并在体内形成畸胎瘤。由于c-Myc属原癌基因，考虑到其明显的致瘤性，在以后的研究中去掉了这个因子，发现仅用Oct3/4、Sox2和Klf4也可同样获得功能正常的iPS细胞。而用Oct3/4和Klf4两种因子甚至仅用Oct3/4一种因子就可诱导小鼠神经干细胞(neural stem cells，NSCs)重编程形成iPS细胞。随后，猴和大鼠的iPS细胞也相继被诱导出来［11］。

除了成纤维细胞，小鼠骨髓细胞、肝细胞、胃上皮细胞、胰腺细胞等也可产生iPS细胞;人iPS细胞可从皮肤的成纤维细胞、角质细胞、造血祖细胞等诱导生成;而终末分化的淋巴细胞和有丝分裂后的神经元［12］也可诱导形成iPS细胞。综合看来，尽管不同细胞产生iPS细胞的效率可能大相径庭，但似乎所有的体细胞都具有被重编程而变成iPS细胞的潜能。

iPS细胞与ES细胞具有高度相似性，且不存在伦理质疑和可能的异体排斥问题，因此一经发现就被研究人员赋予了巨大的临床治疗使命。如目前已从多种退行性疾病的患者体内获得iPS细胞，包括肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、脊髓肌肉萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、脊髓损伤、黄斑变性等，用以进行细胞替代疗法的研究。iPS细胞也非常适用于建立多种遗传疾病的模型，来自疾病特异的iPS细胞不仅可模拟出单基因突变疾病的表型，还适用于迟发性多基因疾病，因而对分析疾病发病机制、探索新的治疗方法等都有令人鼓舞的价值［13］。2010年，Kobayashi等［14］将大鼠iPS细胞注射入有胰腺发育遗传缺陷的小鼠囊胚中，结果在小鼠体内发育出大鼠的胰腺，提示未来利用iPS细胞制造人类器官的应用前景。

3 问题与展望

一直以来iPS细胞受到的最大质疑就是它与ES细胞是否真正相似。虽然有部分结果显示它们存在差异，尤其是在表观遗传学的修饰上有明显不同，但大部分实验数据还是提示两者难以区分。出现不一致的研究结论可能与不同实验室所用的诱导方法、培养条件、重编程因子的顺序等不同有关。Yamanaka认为“这个问题并不重要，ES细胞不应成为判断iPS细胞特性的金标准;研究者应更关注iPS细胞本身，而无需与ES细胞进行比对”。

iPS细胞技术的最大优势就是简单、可重复性高;但这一技术目前仍面临诸多棘手的问题，如高度的成瘤性和转基因的安全性隐患，甚至有人怀疑iPS细胞实际上是将成体组织中的干细胞转变成了癌细胞，而非对成熟细胞的重编程。因此，如何改善iPS细胞产生方法、增加细胞的安全性和有效性将成为今后iPS细胞研究的重点。普遍的观点认为，使用的重编程因子越少，iPS细胞的安全性就越高，如应用Oct3/4一个因子产生iPS细胞;在携带基因的载体方面，与常用的反转录病毒或慢病毒相比，腺病毒或质粒可显著降低整合到宿主基因组中的机会;若进行临床和药物实验，选择取材简单、安全的体细胞也很关键，从脐带血细胞分离获得iPS细胞则可能更具实用价值［11］。近期的研究［15］表明，为了减低成瘤风险，甚至可跨越iPS细胞阶段，直接从一种体细胞类型诱导分化成另一种体细胞，如应用Mash1、Nurr1和Lmx1a直接诱导人成纤维细胞转变成多巴胺能神经元;而在组织原位直接进行细胞重编程的尝试则更具前瞻性［16］。

Gurdon和Yamanaka两位科学家在发育学方面前所未有的发现改变了人们对于细胞分化程序的理解(图3)。虽然Gurdon认为他们两者的研究实际上缺乏内在的联系，但无论是体细胞核移植启动发育进程还是导入多能转录因子产生iPS细胞都为研究疾病的发病机制提供了难得的契机。尤其是来自患者或疾病特异的iPS细胞，通过与健康机体细胞进行比较，可成为研究疾病机理、进行药物筛选和毒性试验的宝贵工具，也可能为未来的疾病治疗提供新的策略。然而，包括Yamanaka本人在内的许多科学家谨慎认为，鉴于iPS细胞还存在大量悬而未决的问题，目前谈及iPS细胞的临床应用、特别是对其再生治疗的价值进行评价还为时尚早。这将成为又一个艰巨的任务，希望攻克它不会再是半个世纪的等待。

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［3］Frisén J，Lendahl U，Perlmann T.Scientific background:mature cells can be reprogrammed to become pluripotent.The Official Web Site of the Nobel Prize.“The 2012 Nobel Prize in Physiology or Medicine-Advanced Information”.［EB/OL］.(2012-10-13).http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2012/advanced.html.

［4］Briggs R，King T J.Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs'eggs［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1952，38(5):455-463.

［5］King T J，Briggs R.Changes in the nuclei of differentiating gastrula cells，as demonstrated by nuclear transplantation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1955，41(5):321-325.

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［8］Yamanaka S.Ekiden to iPS Cells［J］.Nat Med，2009，15(10):1145-1148.

［9］Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors［J］.Cell，2007，131(5):861-872.

［10］Yu J，Vodyanik M A，Smuga-Otto K，et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells［J］.Science，2007，318(5858):1917-1920.

［11］Yamanaka S.A fresh look at iPS cells［J］.Cell，2009，137(1):13-17.

［12］Kim J，Lengner C J，Kirak O，et al.Reprogramming of postnatal neurons into induced pluripotent stem cells by defined factors［J］.Stem Cells，2011，29(6):992-1000.

［13］Yamanaka S.Induced pluripotent stem cells:past，present，and future［J］.Cell Stem Cell，2012，10(6):678-684.

［14］Kobayashi T，Yamaguchi T，Hamanaka S，et al.Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells［J］.Cell，2010，142(5):787-799.

［15］Caiazzo M，Dell＇Anno M T，Dvoretskova E，et al.Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts［J］.Nature，2011，476(7359):224-227.

［16］Qian L，Huang Y，Spencer C I，et al.In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes［J］.Nature，2012，485(7400):593-598.