血管内皮生长因子在火针治疗褥疮小鼠创面中的表达及作用

张丽蕊,阎翠兰,王玉浔,蒋艳茹,王会还,孙瑞军,闫红,安雅臣



血管内皮生长因子在火针治疗褥疮小鼠创面中的表达及作用

张丽蕊1,阎翠兰1,王玉浔1,蒋艳茹2,王会还3,孙瑞军1,闫红1,安雅臣1

(1.河北联合大学附属医院,唐山 063000;2.唐山市中医院,唐山063000;3.河北联合大学开滦医院,唐山 063000)

探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在火针治疗褥疮小鼠创面中的表达与作用。清洁级健康雌性SD小鼠72只随机分为对照组、红外线组、普针组和火针组,建立小鼠褥疮模型,分别于第2 d及治疗后3、7、10、15 d取材病理检测,HE染色观察组织学变化。通过免疫组化结合图像分析等技术,观察各组小鼠创面肉芽组织中VEGF表达情况和微血管的数目(microvessel count,MVC)。经单因素方差分析及两两比较,可以认为火针组VEGF表达及微血管数目与对照组、普针组及红外线组有差别(＜0.05,＜0.01),普针组与红外组疗效无差别(＞0.05)。血管内皮生长因子在火针治疗褥疮小鼠创面中的表达明显高于普针组、红外线组及对照组。

血管内皮生长因子;褥疮;火针疗法;小鼠

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子,它能引起血管通透性增加、细胞外基质成分改变,诱导新生血管形成[1]。褥疮也称压疮,是局部组织长期受压,血液循环障碍,持续缺血缺氧,营养不良而形成组织坏死的压力性溃疡。褥疮好发于昏迷、瘫痪、骨折等长期卧床病人的受压及摩擦部位,如尾骶部、股骨大转子、外踝等骨骼突出之处,因血虚气少,易溃烂。正如张介宾所说“用火先赤其针而后刺之,不但暖也,寒毒固结,非此不可。”火针为高温工具,是针和灸的结合体,具备针刺的机械性刺激和艾灸火热灼伤的温暖性刺激,使病灶逐渐变性、坏死、脱落,新生肉芽,长肌,愈合,形成瘢痕,以起到化腐生新、温通气血、消散固结、疏通经络等作用,最后达到愈合目的。本研究通过建立小鼠褥疮模型,探讨VEGF在火针治疗褥疮小鼠创面中的表达与作用,为临床火针治疗褥疮提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

清洁级SD小白鼠72只,体重(24.9±9.8)g,雌性未孕,由华北煤炭医学院实验动物中心提供。

1.1.2 实验试剂

VEGF(bs-0279R)抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。PV6001试剂盒等均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。兔抗人、大鼠小鼠兔狗牛羊猪VEGF抗体(兔抗鼠,分别l:100、1:50稀释),购自美国Santa Cruz公司。

1.1.3 主要实验仪器及设备

IMS细胞图像分析系统和医学图像分析软件购自上海申藤信息技术有限公司;摄像机(型号MV-CP410)购自Panasonic公司;光学显微镜购自Olympus公司;BH2数码相机购自Nikon公司。针具为苏州医疗用品厂有限公司产品,经环氧乙烷消毒一次性使用华佗牌无菌针灸针。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组

小鼠经编号称重后,按随机数字表法随机分为火针组、普针组、红外线组、对照组,每组18只。动物饲养环境温度18～25℃,湿度45%～55%。

1.2.2 实验装置

由固定装置、加压装置两部分组成。固定装置由木架与离心管组成(图1)。

图1 固定装置

简易木架,一块约100 cm×15 cm长方形木板,两端用两块短板立起用钉固定,两短板上端两边用两根与长木板等长的木条钉成框架,两木条之间用短木条隔开,每个格子正好放入加压装置(塑料瓶)。小鼠固定装置,用50 mL塑料离心管72只,底部开直径约为±1.3 cm圆孔,令小鼠口鼻伸出管外,便于加压期间呼吸进食;管口处开约3 cm×0.6 cmU形口,拉出小鼠右腿暴露于管外以便加压固定;管盖在中心处开直径约0.5 cm圆孔,令尾部伸出管外。为防止塑料管在木板上移动,在木板上做好固定槽,嵌入塑料管用胶带纸固定,以便加压重心稳定。加压装置选用市售康师傅牌(600 mL装矿物质水)方形透明(防滚动)空塑料瓶72只。分别装入特定重量物品,用木制瓶塞,旋入拧紧4 cm长木螺丝,钉帽直径8 mm,总重量47.85 g。加压时将瓶倒立,使钉帽下压在小鼠右腿大转子骨尖上,为使重力加压准确稳定,将塑料瓶固定在木架上。加压部分通过倒立的铁钉来完成,通过计算铁钉底面积,进而计算出木板上需加的重量,使小鼠大腿靠近膝关节处皮肤组织受到9.33 kPa的压强[2-3]。

1.3 褥疮模型创建及确认

分别于小鼠右腿股骨大转子处用8%硫化钠脱毛,装进塑料管内,拉出右腿及尾巴盖好盖胶带固定。再将管固定在固定装置的木板槽内,令股骨大转子脱毛处朝上对准加压装置,开始加压计时,持续加压12 h,间断2次,每次1 h。总加压时间10 h。解压后各组受伤小鼠群养。

肉眼观患处水肿严重,表皮青紫溃破渗出,下肢肿胀粗大,小腿及爪红肿,关节不活动,拉腿爬行,符合3～4度褥疮标准。模型建立48 h后,每组各取1只切取患处全层组织病理检查,结果炎细胞浸润,组织水肿,溃疡坏死,确认褥疮模型创建成功。

1.4 各组治疗及观察项目

1.4.1 治疗时间

褥疮模型确认,解压后第3 d开始治疗,肉眼观察病理检测记录治疗后创面变化,15 d判断效果。

1.4.2 火针治疗方法

取疮面及疮周阿是穴数个,常规消毒,选0.35 mm×11 mm普通毫针,在乙醇灯火上烧红,快速刺至疮面深层,针间距为0.3 cm,共治疗1次。

1.4.3 普通针刺法

取疮面周围阿是穴4个,常规消毒,选0.35 mm×25 mm普通毫针,鸡爪刺至基底部各个方向,不留针,每日1次,连续治疗5次。

1.4.4 远红外线理疗

将小鼠固定创面朝上,理疗仪放置在距疮面15 cm高度,每次照射30 min,每日1次,连续治疗5次。

1.4.5 VEGF表达和微血管数目的观察

观察各组小鼠创面肉芽组织中VEGF表达情况和微血管的数目。

1.5 病理检测

于模型创建第2 d及治疗后第3、7、10、15 d,分别活体取材病理检查,取材后单笼喂养,观察存活率。取材部位为小鼠右腿股骨大转子疮面中心区,呈纵切面切取1 cm×0.4 cm×0.6 cm片状皮肤全层组织,经HE染色制片镜下观察各组不同阶段病理变化。

1.6 免疫组化操作流程

石蜡切片脱蜡至去离子水。采用枸橼酸修复缓冲液进行抗原高压热修复。修复后的切片自然冷却至室温。X-100室温洗涤10 min。3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶,室温10 min。PBS缓冲液洗涤3 min,共3次。滴加特异性抗体,孵育过夜。PBS缓冲液洗涤3 min,共3次。PV6001试剂盒中的试剂(抗兔抗体酶复合物)37℃孵育30 min。PBS缓冲液洗涤3 min,共3次。DAB镜检控制显色。流水冲洗3 h以上,以去除DAB残留物。苏木素复染,脱水,透明封片。结果,阳性部位于细胞浆,呈棕黄色。

1.7 统计学方法

采用Excel2003建立数据库,采用SPSS16.0统计软件进行数据处理。组间同一时间点及组内不同时间点之间比较采用单因素方差分析,以＜0.05表示差异具有统计学意义,以＜0.01表示差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 图像分析法分析VEGF表达量

采用MV-CP410摄像机、IMS细胞图像分析系统,通过显微镜、图像采集卡、数码相机或CCD摄像机采集数字图像。详见图2。

数字图像为标准的BMP(位图)文件格式;在100倍光学显微镜下,先点击图像微尺上的两个点,再将其实际微米数输入计算机,计算机自动计算得到比例因子后存储备用;消除免疫组化图像中的紫蓝色背景,选择阴性区域,处理后用蓝色表示;选择棕黄色或棕褐色阳性区域,处理后用红色表示;测定图像中阳性区域面积和阳性比率以及光密度值,每张切片随机选取3个视野,求出平均值,计算VEGF表达水平。详见表1。

2.2 图像分析法分析微血管数

每张石蜡切片,随机选取肉芽组织区域的3个视野,求出3个视野的平均值,计数微血管的数目(microvessel count,MVC)。详见表1。

表1 小鼠创面肉芽组织中VEGF表达情况和微血管的数目检测结果 (±s)

注:与红外线组、普针组比较1)＜0.01;与对照组比较2)＜0.05

经单因素方差分析及两两比较,我们可以认为火针组VEGF表达及微血管数目与对照组、普针组及红外线组有差别(＜0.05,＜0.01),火针组明显优于其他三组;普针组与红外组VEGF表达及微血管数目优于对照组,但二者之间无差别(＞0.05)。

3 讨论

火针属特殊针法,疗效奇特,操作时间虽然快速短暂,但其后的良性调节及修复作用却是漫长的。可以认为,火针治疗过程就是自身良性调节过程、新陈代谢过程、自行修复过程、免疫功能调节增强过程。事实上火针也是一种伤害性刺激,有意在病灶组织上造成新的良性伤害,可调动自身一切可能的调节手段和机能,使体内许多生长因子会在机体统一调控下积极而有序地参与创伤修复,肉芽组织有序生长,血管再生[4]。实验证明火针有促进病灶坏死、液化,激发自身良性调节机制,释放VEGF等许多生长因子作用,从而促进肉芽组织生长,加速愈合。火针治疗褥疮创伤小,操作简便,治疗时间短,无副反应,不利因素可降到最低限度,有助于整体康复,值得临床推广应用。

[1] 缪玉兰,汪虹.血管内皮生长因子的作用及其在烧伤创面修复中的意义[J].中华烧伤杂志,2006,22(6):478-480.

[2] 姜丽萍,蔡福满,杨晔琴,等.局部皮肤持续受压致压疮的实验研究[J].解放军护理杂志,2007,24(12A):4-5.

[3] 蔡福满,姜丽萍,杨晔琴,等.皮肤压疮缺血再灌注损伤及其作用机制研究[J].护理研究,2006,20(6):1429-1431.

[4] 李岩,周震,贺小靖,等.火针治疗痹症的疗效观察[J].中国针灸, 2003,23(7):408-411.

Expression and Effect of Vascular Endothelial Growth Factor in the Wound Surface in Fire Acupuncture Treatment of Bedsore Mice

1,-1,-1,-2,-3,-1,1,-1.

1.,063000,; 2.,063000,; 3.,063000,

To investigate the expression and effect of vascular endothelial growth factor (VEGF) in fire acupuncture treatment for the wound surface in bedsore mice.Seventy-two clean-class healthy female SD mice were randomly assigned to control, far-infrared, conventional acupuncture and fire acupuncture groups. A mouse model of bedsore was made. The tissue was taken for a pathological examination at the second day, and 3, 7, 10 and 15 days after treatment. Histological changes were observed by HE staining. VEGF expression and microvessel count (MVC) in the granulation tissue of wound surface were observed by an immunohistochemical method and image analysis in various groups of mice.It showed by one-way ANOVA and pairwise comparison that, the expression of VEGF and MVC in fire acupuncture group were significantly different from those in conventional acupuncture group and far-infrared group (＜0.05,＜0.01), and the difference in therapeutic efficacy between conventional acupuncture and far-infrared groups was insignificant (＞0.05).The expression of vascular endothelial growth factor in the wound surface is significantly higher in the fire acupuncture group of bedsore mice than in the conventional acupuncture, far-infrared and control groups.

Vascular endothelial growth factor; Bedsore; Fire acupuncture therapy; Mice

1005-0957(2012)08-0606-03

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2012.08.606

2012-03-20

河北省科学技术研究计划(2008134)

张丽蕊(1970 - ),女,副主任医师,硕士

安雅臣(1977 - ),男,主治医师,硕士,Email:anyachen007@ 126.com