解析食品微生物检验

董树奎

摘要：通过几年的工作感受，我认为传统食品微生物检验生化试验的操作规程，虽然法规性较强，但由于没有具体的检验道理说明，所以对于普通检验员而言，多少会有些茫然，为此我觉得有必要根据所学做一点补充说明。

关键词：食品微生物检验

食品检验的特点是：

①法规性：检验方法必须采用国家法定的检验方法，检验结果具有法律效力。

②要检验的菌少、杂菌含量多。

a需要增加要检验的细菌。

b抑制杂菌。

③检验的范围广。

④检验结果具有数量界限。

⑤采样后要求应尽快检验，快出结果，操作要慎重，结果要准确。

1 生产实验原理

在各种法规检验方法中很重要的环节就是生化试验，设计生化试验的原则就是：在试验过程中加入某些化学物质，使细菌的代谢产物与加入的化学物质产生肉眼可见的变化或特征。以下是我对部分生化试验原理的解释。

①过氧化氢酶及过氧化物酶试验原理：有些微生物可以将过氧化氢分解为水和氧气.

②甲基红试验原理：一些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可被进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸，使培养基的pH值下降到4.5以下，加入甲基红呈红色，阳性。

③V-P试验原理：一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，进一步脱酸产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化成二乙酰（丁二酮），进而与培养基内蛋白胨中所含的精氨酸的胍基发生反应生成红色化合物。

④柠檬酸盐试验原理：一些微生物可以以铵盐作为唯一的氮源，以柠檬酸盐作为唯一的碳源，在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸盐使培养基变成碱性，酸性指示剂变色。

⑤马尿酸盐试验原理：一些细菌可以水解马尿酸生成苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和氯化铁反应生成苯甲酸铁沉淀。

⑥硫化氢试验原理：有些微生物分解含硫氨基酸产生硫化氢，硫化氢与培养基中的亚铁盐反应生成硫化亚铁沉淀，使培养基变黑。

⑦靛基质试验（吲哚试验）原理：一些细菌可以分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质，靛基质可与对二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而成红色。

⑧卵磷脂酶试验原理：一些细菌产生卵磷脂酶，分解卵磷脂产生甘油脂和水溶性的磷酸胆碱，在菌落周围形成一个乳白色的沉淀环或浑浊带，在周围有一个透明圈。

⑨脱氢酶试验原理：微生物有脱氢酶，可使氯化三苯四唑（TTC）还原，由无色变为红色，所以菌落变红色。

⑩淀粉酶实验原理：一些细菌可产生淀粉酶将淀粉分解为双糖或单糖，加入碘，菌落周围不变色。

⑾明胶液化实验原理：一些细菌可产生胞外酶，使明膠蛋白分解为氨基酸，从而失去明胶凝固能力。液化为阳性，仍为固态为阴性。

⑿重点试验——三糖铁试验（TSI）原理：

1.1 成分：牛肉膏、蛋白胨（氮源）

三糖：葡萄糖0.1%、乳糖1%、蔗糖1%。

酚红指示剂、琼脂（pH值调至7.4，培养基摆成高层斜面）。

1.2 接种：

①穿刺接种。

②斜面划线接种（36℃培养18-24h）。

1.3 观察结果：

①分解葡萄糖、乳糖和蔗糖。斜面产酸变为黄色（阳性），底层产酸变为黄色（阳性）。

②分解乳糖、蔗糖，不分解葡萄糖。斜面、底层都产酸，都变为黄色（阳性）。

③分解葡萄糖，不分解乳糖和蔗糖。斜面产碱显红色（阴性），底层产酸显黄色（阳性）。

④分解含硫氨基酸产硫化氢。硫化氢与亚铁离子生成硫化亚铁，使培养基变黑。

⑤分解糖类产气，培养基中有气泡或裂缝。

2 前沿技术的应用原理

2.1 酶联免疫吸附测定﹙ELISA﹚原理：酶与Ab或Ag与相应的Ag或Ab结合，事先将待测标本吸附在固相载体表面，标本中的Ag（或Ab）亦吸附在固相载体的表面，加入酶标Ab（或Ag），酶标Ab（或Ag）与相应Ag（或Ab）结合后不能被缓冲液冲掉。当加入酶相应的底物时，由于酶的催化作用，底物发生反应可呈现颜色反应，颜色的深浅与酶作用于底物所形成的有色物质的量有关，即与待测标本中相应的Ag（或Ab）的量成正比。

2.1.1 注释：固相载体：（聚苯乙烯）

①吸附（也称包被）；Ag或Ab吸附到固相载体的过程，也称之酶标板的致敏。

②封闭：用牛血清填补固相载体上剩余的位点。

2.1.2 基本方法：

①4℃过夜包被Ab或Ag。

②PBS冲洗三遍，每次3分钟。

③加入酶标Ab或Ag（37℃湿盒孵育30分钟）。

④PBS冲洗三遍。

⑤加入OPD和Ｈ2Ｏ2反应15-30分钟。

⑥用2Ｍ浓硫酸终点反应（酶作用时间越长，颜色越深，浓硫酸使酶失去活性）。

⑦用酶标仪测OD值（吸光值）。

此测定方法简便易行、灵敏度高，但易出现假阳性（非特异反应）。

2.2 PCR技术（P-聚合酶 C-链 R-反应）

2.2.1 仪器：PCR仪

2.2.2 三个温度：变性温度90-95℃

退火温度40-60℃

反应温度（合成ＤＮＡ）70-75℃

2.2.3 引抑为一小段寡聚合苷酸，酶为Tag酶。

PCR是扩增DNA，最终与已知菌（即对照）的DBA用电泳方法比较，若相同则是待测菌。