扇脉杓兰AFLP反应体系的建立

李全健 ，王彩霞 ，田 敏 ，李翠新

（1.西南林业大学，云南 昆明 650224；2.中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400）

扇脉杓兰（Cypripedium japonicum Thunb.）属兰科（Orchidaceae）杓兰属（Cypripedium Linn.），生于海拔1 000～2 000 m的灌木林下、林缘、荫蔽山坡等湿润和腐殖质丰富的土壤上[1]。目前对于扇脉杓兰的研究主要集中在传粉生态学[2]方面，有关扇脉杓兰分子生物学相关的研究尚未见报道。

扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）是限制性片断长度多态性（RFLP）技术和聚合酶链式反应（PCR）技术的结合[3]，是一种理想的分子标记技术。已经在杜仲[4]、苹果[5]、葡萄[6]等多种植物[7-8]上建立了AFLP体系，并对菊花[9]、红花[10]等多种植物进行了遗传多样性研究。尽管AFLP标记技术应用广泛，但是其操作复杂，操作中的影响因素较多。建立扇脉杓兰AFLP体系，对进一步研究其种质资源多样性和分子标记辅助育种有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为野生扇脉杓兰嫩叶，取材后立即放入冰盒中带回实验室，保存在-80℃冰箱中。

1.2 方法

SDS 法[11]、高盐低 pH 法[12]、常规 CTAB 法[11]、高盐CTAB法（将常规CTAB法提取缓冲液中的Na－Cl的浓度由 1.4mol/L增至 2.0mol/L，其它和常规CTAB法相同）和改良CTAB法。

试验步骤：将材料研磨成粉末后，取约50 mg的冻粉于离心管中再加入CTAB（50mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、0.7 mol/L NaCl）200 μL 和10μLβ-巯基乙醇，充分混匀后加入800μL 65℃预热的CTAB和10μL蛋白酶K，颠倒数次，65℃恒温水浴 60 min，10 min/次摇匀；取出冷却后加入800 μL 酚∶氯仿∶异戊醇（体积比为 25∶24∶1），颠倒混匀 2 min，静置 5 min后12 000 r/min离心 15 min；取上清液，加等体积的氯仿∶异戊醇（体积比为24∶1）颠倒 2 min，静置5min后12 000 r/min离心 15 min；取上清液，加1/10体积5mol/L的醋酸钠和等体积的异丙醇，沉淀15 min。8 000 r/min离心10 min，去上清；70%乙醇洗涤两次，风干后溶于400 μL去离子水；加入10μL RNase，37℃消化 1 h，65℃水浴20min，稍冷却加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），混匀后 12 000 r/min 离心 15 min；取上清液，加入1/10体积5mol/L的醋酸钠和两倍体积-20℃无水乙醇，－20℃ 沉淀 20 min；8 000 r/min 离心10min；70% 乙醇洗涤两次（10min/次），风干后加40μL去离子水，置－20℃冰箱保存备用。

1.3 DNA纯度及浓度检测

取 5μL DNA 样品，加 1 μL 6×Loading buffer，在1.0%的琼脂糖凝胶电泳；用紫外分光光度计检测总DNA在260 nm和280 nm处的吸光值。根据电泳谱带和A260/A280值判断DNA的纯度，根据公式：DNA 浓度（μgmL-1）=A260×50 μg/mL×稀释倍数，计算总DNA的浓度。

1.4 限制性内切酶酶切分析

1.4.1 酶切体系 酶切反应体系为20μL，各组份为：模板 DNA 1μg，10×NEB 缓冲液 2.0 μL，EcoRⅠ（10 U/L）0.5 μL，MseⅠ（10 U/L）0.5 μL，BSA 0.2 μL，加双蒸水至20μL。为了获得扇脉杓兰DNA酶切的最佳反应时间，酶切时间分别设为 1、2、3、4、5 h。酶切消化后，65℃ 灭活20min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。

1.4.2 连接体系 在20μL反应体系中加入10 μL酶切产物，T4 DNA连接酶反应缓冲液2.0μL，MseⅠ接头 1.0μL，EcoRⅠ接头 1.0 μL，T4 DNA连接酶（400 U/L）1.0 μL，灭菌双蒸水5 μL。16℃连接反应90min，连接反应结束后，65℃灭活20min。

1.4.3 扩增体系 初始扩增体系参照相关研究论文和常规的PCR反应中各组分的量，确定扇脉杓兰AFLP初始反应体系为：反应总体积50μL，内含0.25 μL Ex Taq，5.0 μL 10×Ex Taq buffer，4.0 μL dNTPMixture，4μLMg2+，模板 DNA 2.5 ng，M00 和E00各2.0μL，加灭菌蒸馏水至 50μL。对AFLP反应体系中的5种反应成分分别进行单因素试验（见表1），确定合适反应条件。

表1 PCR反应体系中处理因素和水平

预扩增程序为95℃预变性5 min；然后进行30个循环：95℃变性 30 s，56℃复性 30 s，72℃ 延伸 60 s；循环后 72℃延伸 10min；10℃保存。

选择性扩增程序为：94℃ 5 min；94℃变性30 s，65℃复性 30 s，72℃延伸 70 s；65～56℃ （每个循环降0.7℃）退火30 s，72℃延伸70 s，共13个循环；94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 70 s，共 24个循环；72℃延伸10min，10℃ 保存。

1.4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 取6μL（含上样缓冲液）样品，6%聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h（80W 恒功率）。电泳结束后，银染、拍照，从中选择谱带清晰和容易计数的引物作为AFLP反应的最佳引物。

2 结果与分析

2.1 电泳检测结果

图1所示为改良CTAB法提取基因组DNA 1%琼脂糖凝胶电泳电泳图，DNA电泳条带清晰无拖尾，点样孔无污染，DNA无降解，大小在23 000 bp左右。

图1 改良CTAB法提取的基因组DNA琼脂糖电泳图

2.2 紫外检测结果

由表2所示：5种提取方法在去除蛋白质、多糖及酚类等污染物方面存在差异。改良CTAB法得到的DNA A260/A280在1.8～2.0之间，说明污染物去除较为完全，DNA纯度高。如果A260/A280<1.8，说明DNA被蛋白质或多糖污染。A260/A280>2.0，说明RNA未去除干净。

表2 不同方法提取总DNA结果的比较

2.3 限制性内切酶酶切结果

AFLP分析中基因组 DNA常采用双酶切，通常一个为稀有碱基切点酶，另一个为常见碱基切点酶。根据图2可知，酶切产物电泳均匀，无主条带，主要分布在100～1 000 bp之间，说明酶切消化良好，可以用于分子标记。

图2 酶切效果

2.4 AFLP选择性扩增反应体系的优化结果

2.4.1 预扩增产物的稀释倍数对扩增结果的影响由图3可知，在设定的6个稀释倍数范围内均能扩增出清晰谱带，然而，浓度较大时（稀释5～20倍），小片段的谱带较清晰，当浓度较小时（稀释40～80倍），大片段的谱带清晰可见，而小片段的谱带变弱。因此选定产物稀释20倍为模板DNA。

图3 预扩增产物稀释倍数对选择性扩增的影响

2.4.2 dNTP用量对扩增的影响 由图 4可知dNTP使用量对扩增的影响较大。当dNTP的用量为3.0～4.0μL时扩增条带均清晰稳定，扩增的产物浓度较高；用量少于2.0μL时扩增条带较弱，而用量多于4.0μL（4.0～10μL）时扩增产物变化不大，而且扩增条带减少且不清晰。说明dNTP浓度太低或太高都会使扩增产物减少，影响扩增效果。因此选择3.0～4.0μL为dNTP的适宜用量。

图4 dNTP浓度对选择性扩增的影响

2.4.3 Mg2+用量对扩增的影响 图5显示不同Mg2+使用量条件下的PCR扩增结果。结果显示，2.0 μL的Mg2+用量太低，影响了DNA聚合酶的活性，基本上没有产物或者产物的量较少；用量为3.0～10 μL下扩增条带均清晰稳定，考虑到Mg2+用量过大时容易出现非特异性条带，因此，选择3.0～4.0μL作为Mg2+最优使用量。

图5 Mg2+浓度对选择性扩增的影响

图6 引物用量对选择性扩增结果的影响

2.4.4 引物用量对扩增的影响 引物使用量对扩增的影响较为显著。由图6可见，引物用量为1.5～2.0μL时扩增谱带较为清晰，少于1.5μL时谱带变弱甚至无扩增产物，而用量大于2.0μL（4～6μL）时，谱带出现特异性条带，且位点发生变异，可能是引物浓度过高产生的错配现象。因此，选择1.5～2.0 μL为引物的最佳使用量。

2.4.5 Taq DNA聚合酶用量对扩增的影响 图7表明，随着Taq DNA聚合酶用量的增加，谱带也越来越明亮，Taq聚合酶的用量少时（0.1μL），扩增条带亮度小，说明产物浓度小；但使用量在0.2～0.6 μL的范围内谱带明亮，扩增产物浓度较高，之间亮度在增加但差异不明显。在节省又不影响试验结果的前提下，选取用量0.2～0.3μL可达到试验要求。

图7 Taq DNA聚合酶用量对选择性扩增的影响

2.5 AFLP反应体系稳定性的鉴定

图8为24对引物对优化体系的验证，引物编码记为 E11/M1，E11/M2，E11/M12 和 E12/M1，E12/M2……E12/M12。体系各组分的最佳用量为预扩增产物稀释20倍液4.0μL，dNTP 3.0μL，引物1.5 μL，Taq DNA 聚合酶 0.3 μL，Mg2+4.0 μL，每对引物一个重复，以鉴定扇脉杓兰AFLP反应体系的稳定性。结果如图8所示，24对引物在2个DNA中均能扩增出清晰可辨的谱带，经反复试验表明，利用优化后的反应体系能有效地对扇脉杓兰7个不同群体DNA进行AFLP扩增，而且具有较好的稳定性和可重复性，可以推断，优化后的AFLP反应体系是稳定可靠的。

图8 不同引物选择性扩增电泳图

3 讨 论

植物组织中的多糖、酚、酯和萜等次生代谢物质会对DNA的提取造成较大的困难，样品不纯，会影响后续酶解和PCR反应，研究发现扇脉杓兰叶片中多糖、蛋白质、酚类化合物、等次生代谢产物的含量较高。在提取过程中加入β-巯基乙醇，能够与多酚物质竞争可防止叶片中的多酚物质氧化而使DNA呈褐色。高浓度醋酸钠的引入及相应的低温冰冻，可以提高扇脉杓兰基因组DNA的纯度和得率，建议在提取扇脉杓兰次生代谢物质含量高的植物基因组DNA时采用。

AFLP反应是先进行酶切消化，再对连接产物进行选择性扩增。酶切时间过短，则消化不完全，接头难以连接；时间过长，不仅会延长整个试验周期，而且容易出现星号活性。酶切与连接的时间应控制适当，以确保酶切消化完全和连接充分。预扩增产物的浓度对选择性扩增影响很大，模板浓度过高会引起非特异性扩增；稀释倍数过大，PCR产物过少，影响统计分析。并且体系各组分的多少都会对选择性扩增产生影响。只有对各因素的用量筛选后，才能建立具有较高稳定性的AFLP反应体系。

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