乙型肝炎肝硬化患者外周血调节性T细胞频率及血清IL-1β、IL-6和IL-10水平的变化*

李 晨 邢少军 段学章 胡瑾华 柳芳芳 王慧芬 万谟彬

每年约有2%～6%未经治疗的慢性乙型肝炎患者进展为乙型肝炎肝硬化[1]。研究表明调节性T 细胞（Regulatory T cells，Treg cells）和 IL-10 在体内发挥免疫抑制作用，而IL-1β 和IL-6 则发挥促进炎症的作用。本文通过检测未经抗病毒治疗的乙型肝炎肝硬化患者外周血Treg 细胞及其亚群频率和血清IL-1β、IL-6 和 IL-10 水平，以探讨其临床意义。

对象与方法

一、研究对象 选取我院2010年3月至2010年9月间收治的38 例乙型肝炎肝硬化（LC）患者、17 例慢性乙型肝炎（CHB）患者和20 例正常健康对照者。诊断符合我国2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》[2]和2005年《慢性乙型肝炎防治指南》[3]。

二、Treg 细胞及其亚群频率和血清IL-1β、IL-6、IL-10 水平的检测 采集入组人群外周抗凝血10ml，用淋巴细胞分离液（中国医学科学院生物工程研究所）分离出外周血单个核细胞（PBMC），每管取1×106PBMC 进行细胞染色，第一管加入抗CD4-藻红蛋白（PE，美国 BD Pharmingen 公司）、抗CD25-多甲藻叶绿素蛋白（Percp，美国 BD Pharmingen 公司）；第二管加入抗 CD4-PE、抗CD39-PE（美国BD Pharmingen 公司）。破除细胞膜后，第一管加入抗Foxp3-异硫氰酸荧光素（FITC，美国ebioscience 公司），第二管加入抗Foxp3-FITC和抗 CTLA-4-别藻青蛋白（APC，美国 BD Pharmingen公司）进行细胞内染色。运用ACSCalibur 型流式细胞仪（美国，BD 公司）进行细胞检测，用FlowJo5.7 for windows 软件进行图像分析，计算CD4+CD25+Foxp3+细胞占CD4+T 细胞的百分比作为Treg 细胞频率；分析CD39+CD4+Foxp3+细胞（CD39+Treg 细胞）与 CTLA-4+CD4+Foxp3+细胞（CTLA-4+Treg 细胞）分别占CD4+Foxp3+细胞的百分比，作为Treg 细胞亚群的频率。采用ELISA 法检测血清 IL-1β、IL-6 和 IL-10 水平（美国 RB 公司）。

三、临床指标检测 血生化、凝血功能、HBV M和HBV DNA 均在本院临床检验中心常规进行。

四、统计学方法 应用SPSS13.0 软件进行分析。计量资料用±s 表示，对符合正态分布资料的均数间比较应用t 检验，对不符合正态分布的资料应用秩和检验。直线相关分析用Pearson 法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、三组人群Treg 细胞及其亚群频率和血清IL-1β、IL-6、IL-10 水平比较 见表1。

表1 各组Treg 细胞及其亚群频率及血清细胞因子水平（±s）比较

表1 各组Treg 细胞及其亚群频率及血清细胞因子水平（±s）比较

与正常对照组比，① P＜0.01；与 CHB 组比，② P＜0.05，③ P＜0.01

正常人 CHB LC例数 20 17 38 Treg（%）2.9±0.8 4.3±2.0① 5.7±2.3①②CD39+Treg（%）21.6± 10.2 27.5± 11.0 47.4± 18.6①③CTLA-4+Treg（%）25.2 ± 8.2 27.3± 9.9 33.7 ± 9.5①②IL-1（pg/mL）2.2± 1.1 4.1± 2.8 9.3± 9.9①②IL-6（pg/mL）1.2± 1.5 2.7± 3.3 9.7 ± 10.7①③IL-10（pg/mL）2.8 ± 2.0 3.3± 2.1 6.0 ± 4.2①③

二、代偿期与失代偿期LC 患者Treg 细胞及其亚群频率及血清IL-1β、IL-6 和IL-10 水平比较 见表2。

表2 代偿期与失代偿期LC 患者Treg 细胞及其亚群频率及血清细胞因子（±s）水平比较

表2 代偿期与失代偿期LC 患者Treg 细胞及其亚群频率及血清细胞因子（±s）水平比较

与代偿期组比，① P＜0.01

代偿期 失代偿期例数 18 20 Treg（%）3.9± 1.3 7.3± 1.7①CD39+Treg（%）36.1± 17.5 51.6 ± 13.6①CTLA-4+Treg（%）30.5± 7.7 36.6±10.4 IL-1（pg/mL）7.9±9.3 10.6±10.4 IL-6（pg/mL）6.1 ± 11.2 12.8 ± 9.4①IL-10（pg/mL）5.9 ± 4.7 6.0 ± 3.8

三、LC 患者各项指标相关性分析 Treg 细胞频率与 CD39＋Treg 细胞频率呈正相关（r=0.474，P＜0.01），与CTLA-4+Treg 细胞频率也呈正相关（r=0.330，P＜0.05）；Treg 细胞频率与 TBil 呈正相关（r=0.381，P＜0.05），与 ALB 呈负相关（r=-0.347，P＜0.05），与 PTA 呈负相关（r=-0.549，P＜0.01）；CD39＋Treg 细胞频率与 TBil 呈正相关（r=0.333，P＜0.05），与 AST 呈正相关（r=0.406，P＜0.05），与PTA 呈负相关（r=-0.437，P＜0.01）；CTLA-4+Treg 细胞频率与血肌酐呈负相关（r=-0.336，P＜0.05），与PTA 呈负相关（r=-0.368，P＜0.01）；血清 IL-1β 与IL-6 呈正相关（r=0.397，P＜0.05）。

四、LC 患者Treg 细胞及其亚群频率和血清IL-1β、IL-6、IL-10水平与HBV DNA水平和HbeAg 的关系 以 HBV DNA 水平≥2×106IU/ml将LC 患者分为高病毒载量组和低病毒载量组，分析得出两组患者Treg 细胞及其亚群频率及血清IL-1β、IL-6、IL-10 水平均无显著性差异 （P 均＞0.05）。HbeAg 阳性与 HbeAg 阴性 LC 患者 Treg 细胞及其亚群频率和血清IL-1β、IL-6、IL-10 水平也无显著性差异（P 均 ＞0.05）。

讨论

本研究发现外周血Treg 细胞及其亚群CD39+Treg 细胞、CTLA-4+Treg 细胞的频率和血清IL-1β、IL-6、IL-10 水平在 LC 患者尤其是失代偿期患者体内明显增高，这种变化趋势随着HBV 慢性感染的严重程度而逐渐明显[4～7]，但也与一些研究报告相悖，如有研究表明此类患者体内IL-1β 水平升高，而 IL-6、IL-10 水平较正常人低[8～12]。

本研究发现LC 组Treg 细胞及CD39+Treg 细胞频率与TBil 水平均存在正相关，而Treg 细胞与反映肝脏合成能力的ALB 存在负相关，CD39+Treg 细胞还与反映肝脏炎症程度的AST 存在正相关，反映凝血功能的PTA 则与三种细胞频率均存在负相关，提示Treg 细胞及其亚群可能随着肝硬化程度的加重通过增加频率的方式发挥免疫抑制作用，CD39+Treg 细胞作为功能性Treg 细胞更多的利用CD39 水解酶活性参与抑制肝脏炎症。但是肝硬化阶段特别是失代偿期患者肝脏功能急剧下降并出现不可逆的病理变化，包括CD39+Treg 细胞、CTLA-4+Treg 细胞、IL-10 等抗炎因素的增多也不足以延缓IL-1β、IL-6 等促炎因素促进的病情进展。

[1]Fattovich G.Natural history and prognosis of hepatitis B.Semin Liver Dis，2003，23（1）:47-58.

[2]中华医学会传染病与寄生虫病学分会和肝病学分会.病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志，2000，8（6）：324-329.

[3]中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南.实用肝脏病杂志，2006，9（1）：8-18.

[4]Fukuda R，Ishimura N，Nguyen TX，et al.The expression of IL-2，IL-4 and interferon-gamma（IFN-gamma）mRNA using liver biopsies at different phases of acute exacerbation of chronic hepatitis B.Clin EXP Immunol，1995，100 （3）：446-451.

[5]Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al.Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains （CD25）.Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.J Immunol，1995，155（3）:1151-1164.

[6]Deaglio S，Dwyer KM，Gao W，et al.Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression.J Exp Med，2007，204（6）:1257-1265.

[7]Wing K，Onishi Y，Prieto-martin P，et al.CTLA-4 control over Foxp3+ regulatory T cell function.Science，2008，322（5899）：271-275.

[8]Stoop JN，Vander molen RG，Baan CC，et al.Regulatory T cells contribute to the impaired immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection.Hepatology，2005，41（4）：771-778.

[9]Zhang LJ，Wang XZ.Interleukin-10 and chronic liver disease.World J Gastroenterol，2006，12（11）：1681-1685.

[10]马东瑞，王燕，袁东红，等.Th2 类细胞因子与乙型肝炎病毒相关性肝病的关系.细胞与分子免疫学杂志，2008，24（6）：608-609.

[11]Li WY，Jiang YF，Jin QL，et al.Immunologic characterization of posthepatitis cirrhosis caused by HBV and HCV infection.J Biomed Biotechnol，2010，20（10）：138-141.

[12]Xing T，Li L，Cao H，et al.Altered immune function of monocytes in different stages of patients with acute on chronic liver failure.Clin Exp Immunol，2007，147（1）：184-188.