HPLC测定复方菊陈颗粒中绿原酸的含量

黄 媚 刘喜华

1黄媚（1979.8—），女，助理工程师，主要从事制剂开发和检验工作，广西梧州制药集团（股份）有限公司 广西梧州 543002 2 广西卫生职业技术学院 广西南宁 543002

复方菊陈颗粒是由菊花等多味中药组成的复方制剂，具有散风清热、燥湿健脾等功效，可用于风热感冒、厌食口腻等症状，临床上还将其用于解酒、醒酒等方面。本实验以菊花中的绿原酸为控制指标，采用高效液相色谱法（HPLC）对成品进行质量控制。

1 仪器和试药

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；Ultimate XB-C18（月旭材料科技（上海）有限公司，4.6×250mm，5μm）；BS224S电子天平（北京赛多利斯）；LG-16WA台式高速离心仪（北京京立离心机有限公司）；SB5200DT超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试药

绿原酸对照品，供含量测定用，购于中国药品生物制品检定所，批号为：110753-200413；甲醇、乙腈（美国fisher公司，色谱醇）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；其它试剂为分析纯；复方菊陈颗粒三批（本公司自行研制，批号：110901、110902、110903）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

结合预试验结果，按以下条件和方法进行。色 谱 柱：Ultimate C18柱（4.6×250mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱（详见表1）；流速：1.0mL·min-1；检测波长：328nm；柱温：300；进样量：10μL；理论塔板数计算应不少于7500[1-3]。分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液按照上述色谱条件进行测定。结果表明：供试品溶液中绿原酸能与相邻组分峰分离，分离度R＞1.5，阴性对照品溶液无干扰，色谱图见图1-3。

表1 绿原酸含测梯度洗脱程序（后运行时间：10min）

图1 绿原酸对照品色谱图（a为绿原酸）

图2 供试品色谱图（a为绿原酸）

图3 阴性样品色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取低温真空干燥至恒重的绿原酸对照品适量，加甲醇至溶解制成每1ml中含33.04μg绿原酸对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备

取样品研细1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20ml，称定重量，超声提取60min，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备

按处方比例配制成不含菊花的阴性样品，并按2.2.2项下方法制成阴性样品溶液。

2.3 线性关系考察

精密称取绿原酸对照品4.13mg置于25m1容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，制成浓度为165.2μg/ml的绿原酸对照品溶液，然后分别稀释成 82.6、33.04、16.52、6.608μg/ml。按上述色谱条件，分别吸取这5个对照品溶液10μl进样，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，并计算得回归方程为Y=23.818X-63.398，r=0.9998。结果表明，绿原酸在进样量为0.066μg～1.652μg线性良好。

2.4 精密度试验

精密吸取浓度为33.04μg/ml的绿原酸对照品溶液10μ1，按上述色谱条件重复进样6次，测定绿原酸峰面积，RSD值仅为0.39%，表明仪器的精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在制备后0，2，4，6，8，10，12h精密吸取10μl进样，记录每次进样绿原酸峰面积，RSD值为2.06%，表明供试品溶液在12h内稳定。

2.6 重复性试验

取同一批样品（110901）6份，按供试品溶液的制备方法制备，进样10μl，测定峰面积。计算绿原酸含量。绿原酸平均含量为0.3820mg·g-1，RSD值为2.29%，表明该方法的重复性良好。

2.7 加样回收率试验

取已测得绿原酸含量的样品(110901)6份，每份1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入一定量的绿原酸对照品，按2.2.2项下的方法制备供试品，在上述色谱条件下依法测定，计算回收率，结果见表2。

表2 绿原酸加样回收试验结果

2.8 样品测定

取三批样品研细，取1g，精密称定，按2.2.2项下的方法制备供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液和样品溶液各10μ1，注入液相色图谱仪，测定绿原酸峰面积，外标法计算绿原酸的含量，结果见表3。表中RSD值为0.04%，表明三批样品绿原酸含量稳定。

表3 样品绿原酸含量测定

3 讨论

3.1 预实验曾对绿原酸采用了高效液相的等度洗脱，但在连续注入数个样品之后，后期色谱图基线出现了极大的波动，可能为低极性物质保留时间过长导致，于是将绿原酸的测定改为梯度洗脱，使低极性物质不影响绿原酸的测定，同时节省分析时间。

3.2 供试品中的绿原酸进行DAD扫描，结果发现在328nm处有最大吸收，故确定其作为检测波长。同时对供试品制备方法进行了提取溶剂、提取方法、提取时间的考察，结果表明：甲醇提取的绿原酸比水及乙醇提取的更充分；超声提取比回流提取及索氏提取的更完全；30min、60min、90min提取以60min提取的含量最高，故供试品制备方法按上述最佳条件进行。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2010:292.

[2]陈秋虹，徐慧，蒋艳芳.高效液相色谱法测定桑叶中的绿原酸和芦丁的含量[J].中华中医药杂志，2009,(5):663-665.

[3]吴怀恩，劳深，王雯慧，等.HPLC测定石韦配方颗粒中绿原酸、咖啡酸及芒果苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2010,16(16):54-61.