多巴胺受体D2型基因启动子区CpG岛甲基化状态与Ⅰ型和Ⅱ型精神分裂症的关联

精神分裂症的病因十分复杂，遗传与环境因素之间复杂的相互作用可能是精神分裂症的主要病因［1］，表观遗传修饰能反映这种复杂的相互关系［2］。表观遗传修饰以DNA甲基化最为常见［3］。目前精神分裂症的DNA甲基化研究较多的基因包括颤蛋白（reelin），5-羟色胺转运体（5-HTT），DRD2，等［4－7］，其中DRD2基因是精神分裂重要的候选基因之一，但是既往关于精神分裂症患者DRD2基因启动子区甲基化状态研究结果并不一致［7－8］，可能是因为精神分裂症是一组异质性疾病，有研究者将精神分裂症分成Ⅰ型和Ⅱ型研究，明显增加了样本的同质性［9］。本研究将精神分裂症分成Ⅰ型和Ⅱ型组研究，并拟采用甲基化特异性PCR和直接测序法检测Ⅰ型、Ⅱ型精神分裂症患者组及健康被试组DRD2的启动子区甲基化水平并比较它们的差异，进而或许能判断DRD2基因启动子区CpG岛甲基化是否与精神分裂发病相关。

1 对象与方法

1.1 研究对象 为2008年10月至2011年12月就诊于杭州第一人民医院临床心理科、杭州市第七人民医院的浙江省杭州地区汉族精神分裂症患者。入组标准：①符合中国精神疾病分类方案与诊断标准第 3版（The third Edition of the Chinese Classification of Mental Disorders，CCMD-3）［10］精神分裂症的诊断标准；②阳性与阴性症状量表（Positive and Negative Syndrome Scale，PANSS）［11］评分≥60分；③为首次发病或因停药复发患者；④年龄16-55岁。排除标准：①符合酒精依赖及其他精神活性物质依赖的诊断标准；②合并严重躯体疾病；③合并其他精神疾病。依据Andreasen等的阳性（Ⅰ型）、阴性（Ⅱ型）精神分裂症诊断标准［12］，将研究对象划分为Ⅰ型与Ⅱ型精神分裂症。其中Ⅰ型组共101例患者，包括男55例，女46例。年龄16～55岁，平均（31.75±9.13）岁；病程1个月至5年，平均（18.72±13.29）月。Ⅱ型组共82例患者，包括男50例，女32例。年龄16～55岁，平均（28.61.30±7.90）岁；病程1个月至5年，平均（19.42±11.31）月。

正常对照组：100名健康被试，无精神科疾病，无精神科疾病家族史。包括男50例，女50例，均为杭州第一人民医院保健科健康体检者。年龄16～55岁，平均（31.19±8.46）岁。三组的年龄差异无统计学意义（F＝6.681，P＞0.05）。所有研究对象均取得知情同意书并经过杭州市第一人民医院伦理委员会批准备案。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取患者和健康体检者外周静脉血2mL，用EDTA-K2抗凝。基因组DNA提取采用全血基因组DNA提取试剂盒（北京天根生物技术有限公司）进行操作，提取后－80℃保存备用。

1.2.2 亚硫酸盐处理 严格按照试剂盒（QIAGEN公司甲基化试剂盒）操作说明进行血液基因组DNA亚硫酸实验。

1.2.3 DRD2基因启动子区甲基化特异性 PCR

（MSP） DRD2基因启动子区基因序列来自Gen-Bank，应用“methprimer”（http：／／www.urogene.org／methprimer／）网上在线设计软件设计DRD2基因启动子区的MSP引物，然后对其引物继续Blast验证其特异性。DRD2基因启动子区基因甲基化特异性PCR引物序列：上游 5′-GAGGTTAGGATTAGAAGTTTGTGC-3′，下游 5′-AAAAAATTCCCTTCTA AATAACGAA-3′；非甲基化特异性PCR引物序列：上游 5′-GAGGTTAGGA TTAGAAGTTTGTGTG-3′，下游 5′-AAAAAATTCCCTTCTAAATAACAAA-3′。引物由上海INVITROGEN公司合成。甲基化特异性PCR和非甲基化特异性PCR设置：95℃预变性 3 min；94℃ 30 s，52℃ 20s，72℃ 20s，37个循环；最后72℃延伸5 min。2％琼脂糖凝胶电泳分析MSP扩增产物。DRD2基因启动子区甲基化阳性是指用甲基化和非甲基化引物扩增均有特异性扩增产物，阴性是指仅有非甲基化引物扩增的产物。

1.2.4 直接测序 目的片段的纯化回收与克隆测序：用TAKARA公司提供的DNA纯化与回收试剂对PCR阳性产物进行回收与纯化。将回收产物克隆至PMD-19T质粒中，抽提、纯化、重组质粒，每个样本中挑选2个阳性克隆经PCR法检测正确送到上海英俊公司测序，对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG岛内位点发生甲基化，分析甲基化率（CpG岛内CpG位点甲基化和CpG岛内总CpG位点比例）。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计分析软件包处理数据，采用χ2检验和单因素方差分析进行计数资料三样本率的比较。若方差分析主效应显著，则使用post-hoc法对组间差异进行检测，使用LSD法。检验水准α＝0.01，双侧检验。

2 结果

2.1 DRD2基因启动子区的甲基化检测结果 101

例Ⅰ型精神分裂症患者、82例Ⅱ型精神分裂症患者和100例健康被试的DRD2基因启动子区甲基化阳性率见表1，各组间差异无统计学意义（χ2＝0.579，P＞0.05），PCR 甲基化产物进行回收克隆测序，对CpG位点进行定量分析，发现DRD2基因启动子区有14个CpG位点，最多有8个位点甲基化，最少有0个位点甲基化。对三组被试的DRD2基因启动子区CpG岛内位点甲基化率进行比较，发现三组被试的DRD2基因启动子区CpG岛内位点甲基化率主效应显著［F（2，282）＝5.522，P＜0.01］。Post-hoc检验发现，Ⅰ型精神分裂症患者DRD2基因启动子区CpG岛内位点甲基化率高于Ⅱ型精神分裂症患者（P＜0.01）和健康被试组（P＜0.01）差异有统计学意义，而后两者差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1）。

表1 Ⅰ型精神分裂症组、Ⅱ型组和对照组的DRD2基因启动子区甲基化水平比较

3 讨论

本研究采用病例对照方法，对Ⅰ型和Ⅱ型精神分裂症患者的DRD2基因CpG岛的甲基化状态进行了研究，发现Ⅰ型精神分裂症患者DRD2基因启动子区CpG岛内位点甲基化率显著高于Ⅱ型精神分裂症患者和健康被试组，而Ⅱ型精神分裂症患者和健康被试组之间差异没有统计学意义。

本研究结果显示Ⅰ型精神分裂症DRD2基因启动子区CpG岛内位点甲基化率明显高于健康对照组和Ⅱ型精神分裂症。Petronis等［6］在同卵双生子研究中发现精神分裂发病差异和DRD2基因启动子甲基化状态相关［6］，和本研究结果一致。Zhan等［14］研究发现精神分裂患者中存在DRD2的表达异常，而 Popendikyte 和 Siegfried 等［15－16］的研究显示DRD2基因启动子区CpG岛甲基化对DRD2的表达起作重要的作用。这些都表明DRD2基因启动子区CpG岛内位点甲基化和精神分裂症密切关联。DRD2的总效应是激活脑的精神运动通道，这些通道的过度活跃可能是导致精神分裂症的阳性症状，即幻觉、妄想和偏执等［13］，Ⅰ型精神分裂症主要表现主要是以幻觉妄想为主的阳性症状。Zhang等［7］的研究结果显示DRD2位置特异性的胞嘧啶的甲基化率在精神分裂症和正常对照组之间没有明显的差异，和本研究不一致，可能是因为本研究将精神分裂分成Ⅰ型和Ⅱ型，从而增加了样本的同质性。

本研究显示Ⅱ型精神分裂症患者DRD2基因启动子区CpG岛内位点甲基化水平和健康对照组没有明显的差别。Ⅱ型精神分裂症临床表现主要以思维贫乏、情感平淡等阴性症状为主，而阴性症状主要和大脑的结构异常有关系［17］，和神经元的凋亡有关。Hwang等［18］研究表明精神分裂症的阴性症状和DRD1基因多态性有关。

综上所述，本研究表明DRD2基因启动子区CpG位点甲基化可能是Ⅰ型精神分裂症的发生的重要机制之一，为研制Ⅰ型精神分裂症基因药物提供新的方向。但是是什么因素导致Ⅰ型精神分裂症DRD2基因启动子区CpG位点甲基化的变化还不清楚，有待进一步研究。

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