维拉帕米对静力负荷大鼠骨骼肌线粒体功能的影响

王灿，吴伟，孙佳，杨一龙

(1．沈阳医学院公共卫生学院职业卫生与职业医学教研室，辽宁 沈阳 110034；2．沈阳医学院公共卫生学院预防医学专业2006级18班)

随着科学技术的进步，生产力的发展，生产劳动中自动化、机械化的程度越来越高，有越来越多的作业要求工人长期维持某种固定作业姿势，静力负荷所致肌肉损伤的发病率呈现逐渐上升的趋势。在一些工业化国家已成为主要的职业健康问题，欧美等国已将其列入职业病范畴。在我国职业性肌肉骨胳损伤也日益严重，有调查显示黄石市冶金、建筑、纺织3种行业中行主要作业工人肌肉骨骼疾患的总患病率为87.32%[1]，铁路机械工人肌肉肌肤损伤患病率为54.3%[2]。因此，研究静力负荷所致肌肉损伤的机制和干预性因素，对于预防和治疗这种损伤具有重要意义。目前研究认为细胞内钙失衡是长期静力负荷致骨骼肌损伤的机制之一，维拉帕米是钙通道阻滞剂，通过其干预，探讨对骨骼肌损伤的保护作用，为此我们开展了本次研究，观察线粒体生化指标的变化。

1 实验动物和方法

1.1 实验动物及分组 实验动物由沈阳医学院实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(辽)2010-0002。选取24只雄性Wistar大鼠，体重200～220 g，随机分为3组，即对照组、负荷组、干预组(干预剂+负荷)，每组8只。常规分笼饲养，自由饮食进水，室温20～22 ℃。

1.2 方法

1.2.1 动物处理方法 干预组在实验前30 min，给予干预剂维拉帕米，10 mg/kg左下肢肌肉注射。用2%苯巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，剥离大鼠左下肢比目鱼肌，将远端游离，给予100 g负荷，将大鼠固定在高60 cm的铁架上，每组负荷90 min(图1)。对照组以同样的方式处理，不施加负荷。

图1 左下肢比目鱼肌施加静力负荷的大鼠

1.2.2 大鼠血清、骨骼肌线粒体悬液的制备 施加负荷后在大鼠还处在麻醉状态时，剖腹，剥离出腹主动脉，用12号针头经腹主动脉取血，3 000 r/min，离心15 min，取上层血清-20 ℃冷藏待测。采血完毕后，取0.7～0.75 g比目鱼肌放入小平皿中，量取其质量9倍的冷生理盐水(单位为ml)，放入试管中。在4 ℃条件下用一次性吸管吸取生理盐水加入小平皿中，用眼科剪子将组织剪碎，然后把组织全部转移到手工匀浆器中，在冰上进行手工研磨匀浆6～8 min，然后将匀浆液全部转移到试管中，制得10%匀浆溶液，研磨后组织液经3 000 r/min离心15 min，得到组织匀浆液。将组织匀浆液经10 000 r/min离心15 min，上层为胞浆液，下层沉淀为线粒体，将得到的线粒体沉淀加生理盐水2 ml，用玻璃匀浆器，手工匀浆6～8 min，得到线粒体悬液，整个处理过程在1～4 ℃条件下完成。

1.2.3 生化指标测定方法 (1)血清肌酸激酶

(creatine kinase，CK)测定：其原理是：CK催化三磷酸腺苷和肌酸，生成磷酸肌酸，后者很快全部水解为磷酸，此时三磷酸腺苷和二磷酸腺苷仍稳定，加入钼酸铵可生成磷钼酸，可进一步还原成钼蓝，根据生成无机磷的量可算出酶的活力。(2)血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)测定：其原理是：LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力。(3)线粒体钙浓度测定：取待测样品0.1 ml于10 ml清洁小烧杯中，加5 ml浓硝酸(分析纯)消化24 h，于自控电热消化吸收器中(120 ℃)挥发至溶液无色，在原子吸收分光光度计上测定659 nm处吸光度值，并计算Ca2+含量，以每克蛋白水平(μmol/g)表示。线粒体蛋白定量采用考马斯亮蓝显色剂测定。(4)线粒体Ca2+-Mg2+-ATPase测定：通过酶促水解ATP生成无机磷的水平来表示酶的活力，以mmol/g表示(试剂盒说明书上定义：规定每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷的量为1个ATP酶活力单位。即每小时每微摩尔分子磷/毫克蛋白)。(5)线粒体丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平测定：其原理是过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸缩合形成红色产物，在532 nm处有最大吸光度。以每克蛋白表示(μmol/g)。CK、LDH、线粒体蛋白定量、Ca2+-Mg2+-ATPase、MDA均采用由南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定；Ca2+的含量用原子吸收光谱法测定。

2 结果

负荷组与对照组比较，大鼠血清CK、骨骼肌线粒体Ca2+、Ca2+-Mg2+-ATPase、MDA差异有统计学意义；血清LDH指标差异无统计学意义。负荷组与干预组比较，大鼠骨骼肌线粒体Ca2+、MDA指标差异有统计学意义。见表1。

表1 负荷组与对照组线粒体生化指标比较

注：与对照组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与负荷组比较，3)P<0.05，4)P<0.01

3 讨论

骨骼肌中CK是促进肌肉收缩时被分解的ATP迅速再合成的酶，LDH是糖元无氧酵解代谢途径的关键酶，正常时均存在于细胞内，外周血中含量很少，研究证实肌肉损伤可以引起血清中一些与骨骼肌有关的酶的变化，并以此作为骨骼肌细胞膜通透性增加及细胞损伤的标志。本次静力负荷实验，结果血清中CK活力负荷组与对照组比较增加50.43%，LDH二组比较差异无统计学意义。表明骨骼肌细胞在实验负荷下膜通透性增加或出现损伤，使CK大量从肌细胞中漏出，说明动物造模成功。CK与LDH虽然都是肌细胞损伤的生物标志酶，但是CK的变化要早于LDH，持续时间小于LDH。有报道显示，在运动后CK立即升高，而LDH在心梗发作后12～24 h开始升高。另外，LDH分子量为135～140 KD，大于CK(81 KD)，在通透性增加的一定范围内，LDH的变化不如CK敏感，这与其分子量的大小有关。

细胞生命活动所需能量约95%由线粒体通过电子传递链反应，它通过氧化磷酸化生成ATP供给细胞需要。线粒体又是细胞钙的缓冲器，具有摄取、释放Ca2+以及调节胞浆Ca2+浓度的能力。同时线粒体是对缺氧最敏感的细胞器。所以当大鼠骨骼肌长期处于静力负荷下，引起局部肌肉紧张度增加， 压迫血管，导致肌肉血液供应不足和供氧不足，引起骨骼肌细胞损伤，造成Ca2+内流，胞浆内钙离子增多，不能维持胞浆内低钙水平，线粒体主动摄取过多的Ca2+以缓解浆中Ca2+的过度增加，而线粒体内Ca2+浓度的增加将直接影响整个细胞的能量代谢和Ca2+的平衡。同时，缺血缺氧使肌肉无氧酵解增强，引发脂质过氧化反应，从而破坏组织的抗氧化系统，其产物MDA 和自由基均可对膜系统造成攻击，膜损伤的后果是氧化磷酸化解偶联，ATP生成减少，失去动力的钙泵酶活力降低，加重钙超载。线粒体Ca2+增高，Ca2+-Mg2+-ATPase活力下降和MDA增多，三者交互作用，互相影响，从而影响线粒体正常功能。本实验负荷组与对照组比较，线粒体钙浓度升高、ATP酶活性下降、MDA升高，差异有统计学意义，表明实验条件下的负荷强度可致骨骼肌线粒线生化指标异常，负荷组可以作为干预组的对比观察对象。负荷组与对照组比较，线粒体Ca2+浓度增加111.11%、Ca2+-Mg2+-ATPase活力下降19.48%，MDA含量升高188.57%。表明在本实验负荷下线粒体中生物指标发生了改变，Ca2+浓度增加会引起Ca2+超载，其结果可激活磷脂酶A2，使膜脂降解。其产物游离脂肪酸及溶血磷脂又会产生类似去垢剂样作用，从而使线粒体内膜通透性改变，影响线粒体的功能，导致细胞损害。Ca2+-Mg2+-ATPase活力下降，会加重线粒体Ca2+超载的程度。脂质过氧化产物的增加，表明自由基生成增多，均可成为细胞损伤的直接因素。

维拉帕米作为第一代钙离子拮抗剂， 临床上主要用于心律失常、心绞痛和高血压的治疗。近年来，除了传统的药用价值外，还广泛应用于动物实验研究中，如对大鼠的心肌缺血再灌注的保护性研究[3]、对冻僵大鼠的肝脏和肾脏氧化损伤的保护性研究[4，5]和促进大鼠的坐骨神经再生的协同作用[6]。本研究显示，给予维拉帕米后，干预组与负荷组比较，线粒体Ca2+水平下降228.85%、MDA含量下降49.16%，表明维拉帕米通过影响Ca2+内流，可阻滞因钙超载所启动的细胞损伤机制。干预组MDA含量的减少可能与维拉帕米能有效降低钙超载有关，因钙超载激活Ca2+依赖性蛋白酶，促使黄嘌呤脱氢酶转变为黄嘌呤氧化酶，致使活性氧生成增加。此外，钙超载还可激活磷脂酶A2，通过环加氧酶和脂加氧酶在花生四烯酸形成过程中产生H2O2和·OH。提示用维拉帕米作为干预剂，可降低线粒体钙超载及氧化损伤的作用。

参考文献：

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[4]尹忠伟，杨成君， 王灿，等． 钙通道阻滞剂对重度冻僵大鼠肾脏和肝脏氧化损伤的影响[J]．工业卫生与职业病， 2009，35(1)： 14-17．

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[6]杨飞，张基仁，温有锋，等． 维拉帕米与神经生长因子促进大鼠坐骨神经再生的协同作用[J]． 中国组织工程研究与临床康复，2009，13(37)：7231-7235．