寿胎丸提取液透过妊娠大鼠胎盘屏障的药物成分研究

邓丽丽 宋殿荣 胡丽萍 王跃飞

(1天津中医药大学第二附属医院妇科，300150;2天津中医药大学中医药研究院，省部共建教育部方剂重点实验室;3海洋石油总医院)

寿胎丸是清代名医张锡纯所创，主要功能是补肾、养血、安胎，由炒菟丝子、桑寄生、川续断、阿胶组成，现广泛用于妊娠期，其药效已得到了充分肯定［1-4］，现代药理研究亦表明寿胎丸具有安胎作用［5-7］。目前对寿胎丸的研究主要集中在单味药的化学成分、药理作用及复方的生殖毒性方面［8-14］，对发挥作用的药效物质基础未见详细报道。运用中药血清药物化学［15］方法鉴定血中的移行成分，阐明体内直接作用物质及体内动态过程，可以确定中药复方可能的药效成分。因此，本研究通过对不同孕期Wistar大鼠灌胃STW，采用HPLC研究灌服STW后母血、脐静脉血及胚胎组织中的药物成分，确定透过胎盘屏障的药物成分，阐明中药胚胎毒性可能的物质基础，以评价妊娠期应用的安全性。

1 材料

1.1 试药与试剂 菟丝子、桑寄生、续断、阿胶药材均购于安徽新兴中药材饮片有限公司，经天津中医药大学郭俊华教授鉴定符合国家2010年版药典质量控制标准。标准品绿原酸、金丝桃苷、槲皮苷、山柰酚(批号分别为:110753-200413、111521-200303、111538-200403、110861-200808，中国药品生物制品检定所);马钱子苷、川续断皂苷VI(纯度＞98%，天津中医药大学中药研究院提供);甲醇(色谱纯，德国Merk公司);乙腈(色谱纯，德国Merk公司);乙醇(分析纯，天津市北方天医化学试剂厂);甲酸(分析纯，天津市北方天医化学试剂厂);纯净水(美国Millipore超纯水制备系统)。

1.2 动物 SPF级未交配过的Wistar大鼠，体重约200～220g(雌)，350 ～380g(雄)，天津市山川红实验动物科技有限公司，许可证编号:SCXK(津)2009-001。Wistar大鼠以雌雄1∶2比例合笼，次日清晨查看托盘内阴道栓，将发现阴栓的当日定为妊娠第0天，妊娠第6～10天、11～15天、16～20天分别为孕早、中、晚期。

1.3 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪(包括自动进样器、DAD检测器、Agilent色谱工作站，美国Agi-lent科技有限公司);METTLER TOLEDO AX205(十万分之一天平，瑞士METTLER TOLEDO公司);JA5003A分析天平(准确称量到1mg，上海精密科学仪器有限公司);TOMOS MODEL 2-16A高速离心机(美国TOMOS公司);KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);XW-80A微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂);N-EAVPTM111氮吹仪(美国Organomation公司)。

2 方法

2.1 STW的制备 精密称取干燥的寿胎丸药材粉末0.5g(菟丝子∶桑寄生∶续断∶阿胶 =2∶1∶1∶1)，置 50mL具塞锥形瓶中，加入25mL75%甲醇中，超声处理30min，经0.45μm微孔滤膜过滤后备用。同法处理适量药材，浓缩定容至浓度为1g(药材)/mL提取液，置-20℃冰箱保存。

2.2 对照品溶液的制备 精密称定绿原酸、金丝桃苷、槲皮苷、山柰酚、马钱子苷、川续断皂苷VI等标准品适量，置于10mL容量瓶中，用75%甲醇溶解定容至刻度，配成浓度分别为 0.559、0.504、0.545、0.522、0.560、0.504mg/mL的标准品储备液，并于4℃保存。2.3 生物样品的制备 将早、中、晚期孕鼠随机分为2组，每组3只。实验组按5.4g/kg灌胃STW，对照组灌胃生理盐水1mL/次，1次/日，各孕期连续给药5天，末次给药后1、12h取材。乙醚麻醉后，肝门静脉取血1mL，脐静脉血 0.5mL，剖宫取出胚胎组织。全血14000r/min离心10min，获得血浆。胚胎组织以生理盐水漂洗除去残留血液，滤纸吸干表面水分，称重并记录，锡纸包裹。血浆及胚胎组织均-80℃冷冻备用。

2.4 色谱条件 色谱柱:Agilent Zorbax SB-C18(2.1mm×100mm，3.5μm);流动相:A 为0.05%甲酸水溶液，B为乙腈，(0～40min，7% ～30%B);检测波长:254nm;流速:0.4mL/min;柱温 40℃;进样量:20μL。

2.5 生物样品处理方法 血浆、胚胎组织置于室温条件下融化。孕早期称取全部胚胎组织重量;随机取孕中期及晚期胎鼠各3只，称取胎鼠重量，按胚胎组织:生理盐水(1g∶1mL)的比例加入生理盐水，冰浴条件下，于匀浆器中充分匀浆。

精密吸取0.2mL血浆，加入10μL 0.1mol/L盐酸，涡旋30s，加入甲醇1mL，涡旋1min，室温静置30min，14000r/min离心10min，取上清液，于40℃水浴，氮气吹干。残渣以100μL流动相复溶，涡旋2min，14000r/min离心10min，取上清液进样。精密吸取1mL胚胎组织匀浆液，精确分装于5个炮弹管中，处理方法同血浆。

3 结果

灌服STW后，比对STW、空白血、母血、脐静脉血及胚胎组织HPLC指纹图谱。可知:给药后1h，各孕期母血中均检测到2个色谱峰，分别归属为3号峰(马钱子苷)和8号峰(槲皮苷)，胚胎组织中未检测到待测成分，见图1～图2。给药后12h，各孕期母血、脐静脉血及胚胎组织中均未检测到待测成分，见图3～图4。

图1 给药1h母血HPLC图

图2 给药1h脐静脉血、胚胎组织HPLC图

图3 给药12h母血HPLC图

图4 给药12h脐静脉血、胚胎组织HPLC图2.绿原酸;3.马钱子苷;6.金丝桃苷;8.槲皮苷;12.川续断皂苷VI;13.山柰酚

4 讨论

寿胎丸中主要含有黄酮类和生物碱类化合物，其中菟丝子及桑寄生含黄酮类物质较多［8-9］，最佳检测波长在 365nm［16］，续断中环烯醚萜苷类化合物［10］的最佳检测波长则在212nm［16］。实验条件下，选取360nm波长时，续断可检测的色谱峰少;选取212nm波长响应高，但基线噪声大，造成基线不稳。而在254nm波长下三种药物成分均有较强吸收，能够满足本实验的测定要求。因此，最终确定紫外检测波长为254nm。

一般黄酮类化合物(金丝桃苷、槲皮苷、山柰酚)难溶或不溶于水，偏酸性［17］。酸性物质在胃内的吸收率高于小肠及大肠，一般脂溶性成分易于被消化道吸收，但是药物必须有一定的溶解度才能在消化道中很好地分散、吸收，而黄酮类物质溶解度小，且胃内容物会很快排至小肠及大肠，所以黄酮类物质的生物利用度不高。环烯醚萜苷类化合物多连有极性官能团，极性大，偏亲水性［17］，不易透过消化道内由脂质构成的上皮细胞膜，生物利用度差。因此实验中对不同孕期大鼠给药1h后，仅母血中检测到马钱子苷和槲皮苷两种物质，可能来自川续断和菟丝子或桑寄生;而12h母血中均未检测到任何成分。

药物吸收入血后，随血液分布到机体各组织中。胎盘屏障是存在于母体与胎儿循环系统之间，控制母体与胎儿间的物质流通结构，也是药物由母体进入胎儿的流通结构，可减少药物或毒物的胎儿宫内暴露。药物进入母体后，透过胎盘屏障的药物成分须经脐静脉进入胎儿体内，对胎儿的生长发育产生直接影响，而未透过胎盘屏障的药物成分对胎儿的影响可能较小。经研究可知，实验剂量下，孕早、中、晚期脐静脉血及胚胎组织中均未检测到STW的药物成分，提示妊娠期应用寿胎丸不会造成胎儿的宫内暴露，但对胎儿是否安全还需要大样本的临床观察。

［1］Wramsby M L，Sten L S，Bremme K.Primary habitual abortions are associated with high frequency of Factor V Leiden mutation.Fertil Steril，2000，7(5):987-991.

［2］潘星宇.寿胎丸加味治疗习惯性流产62例疗效观察［J］.光明中医，2004，19(4):59-60.

［3］杨东霞，马宝璋，曲凡，等.寿胎丸治疗抗心磷脂抗体阳性致反复自然流产42 例［J］.中医杂志，2006，47(11):848-849.

［4］秦文敏.反复自然流产的古今文献及方药证治规律研究［D］.广州中医药大学，2009:6.

［5］刘丹卓，尤昭玲，赵新广，等.寿胎丸对大耳白孕兔胚胎-胎仔发育毒性的研究［J］.湖南中医杂志，2009，25(1):89-90.

［6］何冬梅，尤昭玲，赖毛华，等.寿胎丸对反复自然流产小鼠母胎界面CD4+T细胞STAT信号转导途径的影响［J］.中国中医药信息杂志，2010，1(17):23-25.

［7］刘慧萍，尤昭玲，卢芳国，等.寿胎丸对自然流产模型小鼠母胎界面γ-干扰素和白介素-10基因表达的影响［J］.中华中医药学刊，2009，27(7):1447-1449.

［8］胡丽萍，王跃飞，宋殿荣，等.HPLC-UV-M法同时测定菟丝子中5种成分的含量［J］.中草药，2010，33(8):1277-1279.

［9］曹越，彭维，苏薇薇，等.广东从化桑寄生药材的HPLC指纹图谱研究［J］.中药材，2010，33(4):532-535.

［10］刘二伟，吴帅，樊官伟.川续断化学成分及药理作用研究进展［J］.中华中医药学刊，2010，28(71):1421-1423.

［11］柯江维，王建红，赵宏，等.菟丝子黄酮对心理应激雌性大鼠海马-下丘脑-垂体-卵巢轴性激素受体的影响［J］.中草药，2006，37(1):90-92.

［12］丁立，钱江，张颂，等.寿胎丸的药效学和毒理学研究［J］.中药药理与临床，1997，13(5):5-8.

［13］刘丹卓，尤昭玲，赵新广.寿胎丸对SD孕鼠胚胎-胎仔发育毒性的研究［J］.时珍国医国药，2009，20(12):2919-2920.

［14］彭汩.寿胎丸对大鼠妊娠期及胚胎发育生殖安全性的影响［D］.湖南中医药大学.2009:5.

［15］王喜军.中药及中药复方的血清药物化学研究［J］.世界科学技术—中药现代化，2002，4(2):1-5.

［16］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［S］.北京:化学工业出版社，2010:281-309.

［17］吴立军.实用天然有机产物化学［M］.北京:人民卫生出版社，2007:873-1001.