哺乳动物卵母细胞退化机制＊

徐海琦 林辉荣 吴春丽 徐营（嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001）

卵母细胞是哺乳动物体内最大的一种细胞，承载着繁衍后代的使命，而卵子的发育成熟是其完成生殖过程的先决条件。对卵泡的生长、发育和卵子成熟调控机制的研究一直是发育生物学的研究热点之一。

卵母细胞来源于原始生殖细胞（Primordial germcells，PGC），胚胎发育期间，PGC进入生殖嵴不断生长发育，在出生前后停滞在第一次减数分裂前期（即初级卵母细胞），直到性成熟才恢复减数分裂。初级卵母细胞被一层卵泡颗粒细胞包围，构成原始卵泡。性成熟期，原始卵泡启动发育，形成初级卵泡，进一步发育成次级卵泡及最后的成熟卵泡。成熟卵泡随之破裂，发生排卵，此时的卵细胞为具有受精能力的成熟卵母细胞。卵泡发育期间，卵母细胞周围的颗粒细胞也不断增殖和分化［1］（如图）。

图1 卵母细胞与周围体细胞的相互作用

1 卵母细胞的发育、成熟阶段

这是一个非常复杂的动态过程，它主要由2方面的因素调控。一方面通过卵巢内微环境中的细胞因子调控，另一方面是通过下丘脑—垂体—卵巢所释放的激素调控，即中枢神经内分泌进行调节。生长因子对卵母细胞成熟的作用是正向的。发育卵泡中存在多种促生长因子及其受体，它们同时影响卵膜细胞和颗粒细胞的增殖和分化，并参与调节卵母细胞的成熟。卵巢内微环境局部的卵泡膜细胞、颗粒细胞以及卵母细胞等产生的自分泌和旁分泌调节因子，直接调控卵子的发育和成熟。研究表明，卵巢组织内合成分泌的白细胞介素（Interleukin，IL）［2］、胰岛素样生长因子－1（Insulin－like growth factor－1，IGF－1）［3］、表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）［4］、转化生长因子－β（Transforming growth factor－β，TGF－β）［5］、生长分化因子－9（Growth differentiation factor－9，GDF－9）、骨形态发生蛋白－15（bone morphogenetic protein－15，BMP－15）［6］、成熟促进因子（M－phase promoting factor，MPF）［7］等多种非激素类分子参与调节卵细胞的发育与成熟过程。近年来，随着分子生物学的研究进展，围绕丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）信号通路［8］、G蛋白耦联受体介导的信号通路、受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase－Ras，RTK－Ras）信号通路、磷脂酰肌醇3－激酶（Phospho－inositide 3－kinases，PI3K）－蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB或 Akt）信号通路、TGF－β信号通路、Wnt信号通路等在卵细胞发育成熟过程中的作用，也进行了较为系统的研究。

卵母细胞成熟抑制因子（OMI）是指卵泡液中能够抑制卵母细胞成熟的物质。OMI是一个多肽，分子量约为1～2kDa，许多哺乳动物卵巢的卵泡液中均存在，并且在卵母细胞体外培养中可阻止自发减数分裂成熟。目前研究较多的成熟抑制因子有环核苷酸和嘌呤。FST主要在卵巢的颗粒细胞中合成，而颗粒细胞又是与卵母细胞直接接触的唯一的细胞，因此，FST在卵母细胞的成熟与退化过程上起着非常重要的作用。FST可以通过调节卵巢颗粒细胞的分化和成熟，并与活化相互作用，影响卵泡发育与闭锁，继而影响卵母细胞成熟过程［9］。

另一方面是通过下丘脑—垂体—卵巢所释放的激素调控，即中枢神经内分泌进行调节。激素是促进卵母细胞成熟的重要物质，如促性腺激素、性激素及类固醇激素等［10－12］。激素是哺乳动物卵母细胞成熟的重要物质。目前，绝大多数研究者在卵母细胞的体外成熟培养过程中，添加促性腺激素或类固醇激素或两者的混合物。但是，它们在卵母细胞体外成熟过程中的作用及作用机理尚未清楚。根据已有的研究结果推测，激素诱导卵母细胞恢复减数分裂可能通过2条途径：①诱导卵丘扩散使颗粒细胞与卵母细胞的间隙连接中断，使卵丘细胞的信息不能传入卵母细胞，从而解除卵丘细胞对卵母细胞恢复减数分裂的抑制作用，重新启动减数分裂。②诱导卵丘细胞产生一些刺激因子，克服抑制物质的作用而恢复减数分裂。现在，体外成熟培养中，主要以添加LH和hCG为主。Funashi等的研究表明，在猪卵母细胞体外成熟时，培养的前20h加入激素，培养20h后去掉激素，可增加卵母细胞体外成熟率，促进卵母细胞的减数分裂和细胞质成熟。同时指出，在猪卵母细胞体外成熟中，有两个关键步骤是受激素调节的。一是核成熟，它可由培养的前20h加入激素所激发；二是细胞质成熟，在培养的后20 h去掉一部分或全部激素可以促进细胞质的成熟［13］。Delos－Reyes［14］等的研究也发现，在猪卵母细胞体外培养的第2阶段去掉激素可以提高卵母细胞的体外成熟率。

有研究报道，猪卵母细胞的体外成熟伴随卵丘细胞的扩散，扩散的卵丘细胞能够调节诸如氨基酸、核苷酸、磷脂酸、激素、蛋白质等物质在卵母细胞内外的进出，诱导卵母细胞排出有害因子，从而有效地抑制卵母细胞的退化［15－16］。卵母细胞在生长发育中所释放的生长因子对卵丘细胞的生长也有一定的促进作用，卵母细胞与卵丘细胞的这种相互作用使得两者共同发育生长，最终促进了卵母细胞的成熟。

2 卵母细胞退化机制

减数分裂紊乱以及细胞分裂基因的表达异常是人类以及其他高龄哺乳动物卵母细胞退化的主要机制之一。卵母细胞的减数分裂是由很多因子参与的精确、有序的调节过程，其中后期同源染色体／姐妹染色单体的分离对于维持基因组的完整性起重要作用，其分离缺陷会引起非整倍性，并导致出生缺陷。Hassold等研究认为卵母细胞的质量低下、数量下降，由减数分裂错误引起的卵母细胞质量下降是与衰老相关生育力下降的主要原因之一［17－19］，即发生了与年龄相关的卵母细胞退化。卵母细胞退化是衰老造成母源性生育力下降的主要因素。

Tarín的实验表明，老化的卵母细胞受精产生的后代繁殖性能和寿命均下降［20］。可见，老化的卵母细胞对后代产生了严重负面影响。然而是什么机制导致了排卵后卵母细胞的老化，卵母细胞在老化过程中究竟发生了哪些变化是目前研究的热点。

老龄动物的卵母细胞恢复减数分裂前在卵巢内停滞很长时间，这漫长的时间里，各种各样内在和外源的因素可以引起纺锤体前体的降解和染色体损伤，其中与线粒体有关的氧化应激是一主要因素。Friedman等［21］报道随年龄而增加，缺氧直接引起或再充氧后间接引起氧化应激产生。氧化应激损伤衰老期间的DNA和染色体及蛋白质，这些蛋白质可能涉及到对纺锤体组装重要的微管和小分子。许多染色体相关或着丝粒相关的蛋白质，如Mps1、Mad2和Xkid，已表明在染色体于纺锤体中期板上的排列发挥重要作用［22］。总之，老龄个体减数分裂异常可能是许多因素损伤了纺锤体和染色体成分和／或改变了减数分裂各时期的时序，导致纺锤体紊乱和染色体排列异常。卵母细胞在遗传学及生物学方面受到年龄的影响，其中由分裂错误所导致的非整倍性增加和染色单体早现被认为与衰老相关卵母细胞质量下降方面起有主要作用。在人，卵母细胞和胚胎非整倍性的比率随母体年龄增长而显著增加［23］，Eichenlaub－Ritter［24］统计了4000多个老龄人的 MⅡ期卵母细胞，其中8.6%为超倍性，13.5%为低倍性，因此保守的估计（非整倍性相当于2倍超倍体的水平）有17.2%的卵母细胞染色体异常，在估计整个非整倍性水平时若也算上低倍性则有20%以上的卵母细胞染色体异常。考虑到MⅡ期卵母细胞的非整倍性仅反映了第一次减数分裂错误的程度，完成第二次减数分裂后非整倍性的比率在老龄个体会更高。Eichenlaub－Ritter等［25］报道老龄小鼠MⅡ期卵母细胞染色体数异常的比例显著高于年轻小鼠，同时高比例（P＜0.001）的老龄小鼠卵母细胞在 MⅡ期含一条或几条染色单体。

现在发现了许多与卵母细胞退化相关的基因。这些基因包括 GDF29、Fac、AtrPAtm、Mlh1、Zfx、ER、Cyclin D2、Connexin 37、bcl－2、ob、c－mos、p27〔kip1〕、C／ERPbeta、Hook等，它们的特征表现为以下几个方面：①影响卵巢发育及卵泡成熟，如p27〔Kip1〕、c－mos，敲除这些基因将导致排卵数的下降，但有关的调控机理目前尚不清楚；②调控细胞周期并影响卵母细胞的减数分裂，如AtrPAtm，它们分别定位于减数分裂中联会与非联会的染色体上，将它们敲除会导致偶线期P粗线期的阻滞。而缺少c－mos的卵母细胞则会产生异常的纺锤体及错误的染色体浓缩，最终导致卵母细胞MⅡ期阻滞的失败，激活孤雌生殖；③对激素调控起作用，如ER等；④与染色体分离和微管骨架有关。Hamatani等［26］研究发现随着母亲年龄增大，Cggbp1等与染色体分离及微管骨架有关的基因转录下降。

通过对酵母的研究发现，粘着蛋白（Cohesin）可以调节染色体的正确分离，姐妹染色单体是靠粘着蛋白形成的粘着力紧密的连在一起，在S期与姐妹染色单体结合，在中期向后期过度时从染色体上解离的。2001年Dobie等人研究发现了wapl基因与染色体的分离有关，但具体机制并不是很清楚。突变的wapl基因在异染色质区域阻止了姐妹染色单体的正常靠近和并列，但是不影响染色体的凝集和分离。wapl基因在有丝分裂的异染色质区域对于维持姐妹染色单体的粘连起着非常重要的作用，具有调节染色体遗传的功能。在293T细胞wapl的过表达使细胞早熟姐妹染色单体分离频率增高，引起非整倍的产生。wapl缺失后细胞就短暂的停滞在前中期，姐妹染色单体分离率下降，并在后期出现多分裂核现象，同时粘着蛋白表达量也增加。许多染色体相关或着丝粒相关的蛋白质，如 Mps1、Mad2已表明在染色体于纺锤体中期板上的排列发挥重要作用。而在卵母细胞成熟发育过程中，染色体的分离依赖于纺锤体，若纺锤体出现异常，细胞分裂就不能正常完成，从而卵子就不能进行正常受精、卵裂。

减数分裂异常是卵母细胞退化的一种显著特征。低质量的卵母细胞影响减数分裂中染色体的分离，导致胚胎在附植前后丢失或产生三倍体，进而影响人类及其他哺乳动物的生育。有证据表明老龄动物卵母细胞在第二次减数分裂时也出现异常。Liu等发现MⅡ期结束时非整倍体的比率在老龄鼠中明显升高，这表明染色体的错误分离在减数分裂期也有发生，而且确实与母亲年龄相关。此外，Battaglia与Volarcik等发现，与年轻女性的卵母细胞相比，中老年妇女的MⅡ期卵母细胞纺锤体更松散，而且染色体与纺锤体在不同的位点无规则地相连。

3 展望

综合以上所述，衰老导致的哺乳动物卵母细胞发育成熟过程及体外老化过程中所发生的变化，尤其是细胞分裂（减数分裂）相关分子表达变化的研究方面还处于起步阶段，存在诸多的未知未明之处，有待于进行进一步的研究。

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