葛根素通过ERK1／2信号通路促进内皮细胞增殖

唐哲明 梁国荣（广西医科大学第四附属医院（柳州市工人医院）整形外科，广西 柳州 545005）

葛根素系从豆科植物野葛或甘葛藤根中提取的一种黄酮苷。其化学名称为：8－β－D－葡萄吡喃糖－4’，7－二羟基异黄酮。有扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量，改善微循环和抗血小板聚集的作用［1－3］。已有研究表明，葛根素有促进内皮细胞增殖作用［4－9］，本研究以体外培养人脐静脉内皮细胞HUVEC为模型，研究葛根素对HUVEC细胞增殖及凋亡的影响，并测定p－ERK1／2蛋白的表达，初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

葛根素（HPLC＞98%）购于上海经科化学科技有限公司；四甲基噻唑兰 （MTT）购于Invitrogen公司；磷酸化ERK1／2抗体及辣根过氧化酶标记二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 细胞

人脐静脉内皮细胞株（HUVEC－12）培养于含10%胎牛血清、100U·ml－1青霉素和100μg·ml－1链霉素的DMEM培养液中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.3 方法

1.3.1 MTT法检测细胞活性

取对数生长期HUVEC－12细胞经胰酶消化后，以2×104·孔－1的细胞密度接种于96孔板，每孔100μl。继续培养24h待细胞完全贴壁后，移去上层培养液，加入含不同浓度葛根素（1、5、10、20、40、80、160μM）的新鲜培养基。空白对照组只加入培养基。继续培养48h后，每孔加入MTT溶液（5mg·ml－1）20μl，孵育4h，吸去上清液，每孔加 DMSO 150 μl，避光振荡10min，在全自动酶标仪上于490nm波长检测各孔吸光度（OD）值。细胞增殖率＝处理组OD值／对照组OD值×100%。

1.3.2 流式细胞术

收集对数生长期细胞，调整细胞浓度，以每孔1×106个细胞接种到6孔板中。24h后，加入不同浓度葛根素（20、40、80 μM）及空白培养基，继续培养48h后，胰蛋白酶消化收集各组细胞，1000rpm·min－1离心5min，加预冷的PBS洗涤2次后，Annexin V－FITC及碘化丙啶（PI，50μg·ml－1）室温避光染色，15min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡。总凋亡细胞率＝早期凋亡细胞率＋晚期凋亡细胞率。

1.3.3 Western Blot

收集对数生长期细胞接种于6孔板中。待细胞融合至90%，加入不同浓度葛根素（20、40、80μM）及空白培养基处理1h后，预冷PBS洗涤，加入蛋白裂解液置于冰上裂解30min后，4℃，12000rpm·min－1离心5min，取上清液。用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，加入5×SDS上样缓冲液，95℃煮沸5min变性，行SDS－PAGE凝胶电泳后，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2h。分别将膜置于p－ERK1／2及β－actin单克隆抗体，4℃孵育过夜，TBST漂洗3次后，二抗室温孵育2h，TBST漂洗3次，ECL显色，暗室曝光并拍照。以β－actin为内参，用Quantity One软件进行条带分析。

1.4 统计学方法

用SPSS13.0版进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差表示，两组间的显著性差异采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 葛根素对HUVEC细胞增殖的影响

MTT结果显示（图1），经葛根素作用48h后，与空白对照组比较，80μM及以下各浓度组细胞增值率＞100%，且呈剂量依赖性。其中以20μM、40μM及80μM浓度时，促增殖作用最为明显，增殖率分别达118.06%、135.92%及165.45%（P＜0.01）。随葛根素浓度增加至160μM，细胞增殖受到抑制，增值率为95.1%。葛根素在较低浓度时能够剂量依赖的促进HUVEC细胞增殖。

图1 不同浓度葛根素对HUVEC细胞增殖的影响

2.2 葛根素抑制HUVEC细胞凋亡

经流式细胞术检测凋亡率，如图2所示，与空白对照组（14.23%）比较，经过不同浓度葛根素（20、40、80μM）处理48h后，各组细胞凋亡率分别减少到12.94%，9.63%，6.5%（P＜0.01）。

图2 葛根素对HUVEC细胞凋亡的影响

2.3 葛根素诱导磷酸化ERK1／2蛋白的表达

为探讨葛根素促进HUVEC细胞增殖的分子机制，本实验采用Western Blot方法检测经不同浓度葛根素处理1h后磷酸化ERK1／2蛋白表达水平的改变。与空白组相比，葛根素能剂量依赖性增加ERK1／2磷酸化水平（图3），以40μM及80μM浓度尤为明显（P＜0.01）。

图3 葛根素对磷酸化ERK1／2蛋白水平的影响

3 讨论

血管内皮细胞是血管内内循环介质与组织间隙的机械屏障，其分泌的多种细胞因子在烧伤早期炎症反应中发挥重要作用。烧伤可造成血管内皮细胞受损、功能异常或凋亡，血管内皮机械屏障被破坏，加速炎症反应［10－12］。因此研究药物对内皮细胞增殖凋亡的影响，对于烧伤后组织的恢复具有重要意义。葛根素对HUVEC细胞有促进增殖的作用，并且减少HUVEC细胞早期凋亡率。

丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）是一组可被多种信号激活的丝／苏氨酸激酶。经双重磷酸化激活后可参与细胞的多种生物活性，如调节基因转录，诱导细胞凋亡、调节细胞周期等。ERK1／2信号通路是最早发现的经典的Ras－Raf－MAPK信号转导途径，在细胞分裂、迁移及存活。主要参与各种生长因子、细胞因子、丝裂原以及激素受体活化后的信号转导，参与内皮细胞的生存、增殖［13－15］。我们的结果提示葛根素有激活磷酸化ERK1／2，呈剂量剂量依从性。因此葛根素诱导HUVEC细胞的增殖，抑制其早期凋亡主要是通过ERK1／2信号转导通路实现的，考虑到葛根广泛应用于临床，本研究为其提供了理论依据。

1 夏华玲.葛根素的药理作用研究进展［J］.时珍国医国药，2006，17（3）：434－435.

2 宋卉，李银花，郑晖，等.葛根素的药理作用与临床研究进展［J］.现代医药卫生，2011，27（19）：2936－2937.

3 虞丹.葛根素对血管内皮功能的作用［J］.海峡药学，2008，20（2）：67－69.

4 张明宇，时志斌，杨华清，等.不同浓度葛根素对体外培养血管内皮细胞增殖的影响［J］.中西医结合学报，2008，6（9）：942－945.

5 罗伟，李菊香，陈静，等.葛根素对人脐静脉内皮细胞功能保护机制的研究［J］.江西医药，2007，42（3）：220－223.

6 高爱社，沈晓君.葛根素对oxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡的防护作用［J］.山东中医杂志，2008，27（5）：334－335.

7 高培国，强辉，凌鸣.葛根素对过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用［J］.西安交通大学学报，2012，33（2）：245－260.

8 石瑞丽，张建军.葛根素对缺氧性血管内皮细胞凋亡的保护作用［J］.药学学报，2003，38（2）：103－107.

9 王春玲，傅攀峰，李宏伟，等.葛根素对血管内皮细胞DNA损伤的保护作用［J］.中国微循环，2004，8（6）：361－364.

10 周锐华，鄢文海，孙永华.烧伤后血管内皮细胞的损伤与治疗［J］.中华损伤与修复杂志，2009，4（3）：346－351.

11 黄巧冰.内皮细胞屏障与烧伤后血管通透性的关系及机制［J］.中华烧伤杂志，2007，23（5）：324－326.

12 张庆富.烧伤后微血管功能变化及其体液调节［J］.中华损伤与修复杂志，2011，6（2）：174－182.

13 白芸，龙启福.MAPK在细胞凋亡中的研究进展［J］.微量元素与健康研究，2011，28（3）：58－59.

14 王文，任玲，王健楠.MAPK信号通路与细胞凋亡的关系［J］.中国实用医药，2010，5（15）：260－261.

15 张曼.血管内皮细胞的ERK信号转导通路调节机制研究［J］.中国实用医药，2009，4（25）：250－252.