石榴果实酚类物质测定体系优化与不同部位组分及含量测定

韩玲玲　苑兆和　冯立娟　杨尚尚　朱峰

摘 要：以“泰山红”石榴为试材，利用高效液相色谱仪（HPLC）测定成熟期石榴果实中果皮、籽粒和果汁中酚类物质的组分及含量。色谱条件：色谱柱为Kromasil 色谱柱（250 mm×46 mm， 5 μm），以乙腈-1%乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。流速为11 ml/min，柱温30℃，检测波长280 nm。结果表明：在石榴皮和石榴籽中检测到13种酚类成分，包括没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、表儿茶素、咖啡酸、儿茶素、香草醛、阿魏酸、苯甲酸、根皮苷、槲皮素、肉桂酸、根皮素；在石榴汁中检测到上述12种酚类物质，未检测到表儿茶素。石榴皮中酚类物质的含量最高，其次是石榴汁和石榴籽，其中石榴皮中主要的酸性酚类物质和类黄酮类化合物分别为对羟基苯甲酸（0828 mg/g）和表儿茶素（0915 mg/g）；石榴汁中分别是对羟基苯甲酸（0121 mg/g）和儿茶素（0149 mg/g）；石榴籽中分别是咖啡酸（0026 mg/g）和根皮苷（0075 mg/g）。

关键词：石榴；多酚；高效液相色谱

中图分类号：S665.4 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）11-0112-05

Optimization of Detection System for Polyphenol and Its Compositions

and Contents in Different Parts of Pomegranate Fruit

Han LingLing1，2，Yuan ZhaoHe2*，Feng LiJuan2，Yang ShangShang1，2，Zhu Feng1，2

（1. College of Forestry， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China；

2. Shandong Institute of Pomology， Taian 271000， China）

Abstract A high performance liquid chromatographic method was developed for the analysis of polyphenol compositions and contents in different parts of ‘Taishanhong pomegranate fruit including peel， seed and juice. The chromatographic separation was performed on a Kromasil （250 mm×4.6 mm， 5μm）. The mobile phase was acetonitrile and 1% acetate acid solution for gradient elution. The column temperature was 30℃； the flow rate was 1.1 ml/min and the wave length was 280 nm. The results indicated that thirteen phenolic compounds were identified in pomegranate peel and seed， including gallic acid， chlorogenic acid， parahydroxybenzoic acid， epicatechin， caffeic acid， catechin， vanillin， ferulic acid， benzoic acid， phloridzin， quercetin， cinnamic acid and phloretin. Twelve phenolic compounds were identified in pomegranate juice， and epicatechin was not detected. The content of polyphenols was the highest in pomegranate peel， followed by pomegranate juice and pomegranate seed. The major acidic phenolic compound and flavonoid compound in pomegranate peel were parahydroxybenzoic acid （0.828 mg/g） and epicatechin （0.915 mg/g） respectively， while those in pomegranate juice were parahydroxybenzoic acid （0.12 mg/g） and catechin （0.149 mg/g） respectively， and those in pomegranate seed were caffeic acid （0.026 mg/g） and phloridzin （0.075 mg/g） respectively.

Key words Pomegranate； Polyphenol； HPLC

石榴（ Punica granatum L ），原产伊朗和阿富汗等中亚地区，在中国至今已有2 000多年栽培历史[1，2]。石榴果实营养价值较高，除含有丰富的糖、有机酸、维生素和矿物质等营养成分外，还含有丰富的酚类物质，石榴多酚是石榴中所含多元酚类物质的总称[3～5]。大量的研究证明：石榴多酚具有多种保健功能，如抗氧化性、抗癌抗突变、抑制心脑血管疾病和抑菌等，其抗氧化活性在苹果、石榴、橄榄、芒果、香蕉、菠萝、葡萄和龙眼这八种水果中最高[6～10]。我国石榴种质资源丰富，石榴多酚作为一种新型的功能食品成分具有很好的开发前景。

石榴多酚种类繁多，可以分为鞣质类化合物（如安石榴林、安石榴苷、石榴皮亭A和石榴皮亭B等）、黄酮类化合物（如芦丁、儿茶素、槲皮素和山萘素等）和酚酸类化合物（如咖啡酸、原儿茶酸、阿魏酸和绿原酸等）[11～13]。目前国内关于石榴多酚的研究主要集中在石榴多酚的提取方法、抗氧化性测定和总多酚含量的测定[14～18]等方面，有关石榴多酚HPLC检测方法的报道较少[19，20]。本研究以“泰山红”石榴为试材，利用高效液相色谱仪测定石榴果实不同部位酚类物质的组分及含量，以明确石榴果实不同部位酚类物质组分及含量的差异，为石榴酚类物质的开发利用提供理论依据。1 材料与方法

11 材料与试剂

本试验于2011年9～12月在山东省果树研究所观赏园艺室进行。以“泰山红”石榴为试材，果实于成熟期采自山东省果树研究所石榴种质资源圃。

多酚标准品：没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、表儿茶素、咖啡酸、儿茶素、香草醛、阿魏酸、苯甲酸、根皮苷、槲皮素、肉桂酸、根皮素，纯度≥98%，天津一方科技有限公司。甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙酸乙酯（分析纯）、冰乙酸（分析纯），天津永大试剂责任有限公司。

12 仪器与设备

Waters 510高效液相色谱仪，配有Waters 2487双波长紫外检测器和Kromasil 色谱柱（250 mm×46 mm， 5 μm），美国Waters公司；ALPHA1-4真空冷冻干燥机，德国CHRTST公司； PHS-2C实验室pH计，上海伟业仪器厂；HY-2型调速多用振荡器，富华电器有限公司；centrifuge 5810R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。

13 方法

131 样品的制备 将采回的石榴样品洗净擦干，把石榴皮、石榴籽、石榴汁分离。为防止分离过程中发生酶促褐变，将石榴皮和石榴籽分别浸泡在3%的柠檬酸溶液里，经冷冻干燥后用组织粉碎机粉碎，备用。石榴汁经冷冻干燥后，放入-20℃冰箱中，备用。

取10 g石榴皮干粉加入10 ml超纯水，用l mol/L NaOH调pH至70，加入10 ml乙酸乙酯，摇床上摇动15 min，4℃、5 000 r/min离心15 min，分离出酯相和水相，水相再用上述方法萃取2次，合并酯相，此为中性酚。水相用6 mol/L HCl调pH至20，再分别用10 ml乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，此为酸性酚。将中性酚和酸性酚合并后真空浓缩至干，残渣溶于40 ml的甲醇中，过022 μm滤膜，放入-20℃冰箱中冷藏保存备用。

石榴籽和石榴汁的多酚提取同上。

132 标准溶液的配制 分别准确称取60 mg没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、表儿茶素、咖啡酸、儿茶素、香草醛、阿魏酸、苯甲酸、根皮苷、槲皮素、肉桂酸、根皮素，用甲醇分别定容至10 ml，得每个标准品的标准溶液。分别移取50 ml，混合定容至100 ml，得13种标准品混合液。标准品溶液不使用时放4℃冰箱中保存。

133 测定方法 在确定好的色谱条件下，标准品混合液和样品溶液分别进行HPLC分析，进样量为10 μl。将样品色谱图与标准品色谱图比较，根据紫外线吸收和保留时间进行定性分析，依据外标法和峰面积计算出每种酚类物质的含量。

2 结果与分析

21 色谱条件优化

211 最佳检测波长确定 利用紫外分光光度计扫描13种单酚标准品在200～400 nm全部紫外光波长范围内的信号，可获得13种多酚物质的最大吸收波长（表1）。在各物质的最大吸收波长下进行检测，可以获得最高的检测灵敏度。但鉴于各种物质在280 nm左右均有吸收，且不受流动相的影响，为能同时测定所有单个酚类物质的含量，最终确定检测波长为280 nm。

表1

酚类化合物最大吸收波长比较

酚类物质 最大吸收波长

（nm） 酚类物质 最大吸收波长

（nm）

没食子酸 270 阿魏酸 235；325

绿原酸 320 苯甲酸 201；230

对羟基苯甲酸 256 根皮苷 280；325

表儿茶素 278 槲皮素 280；371

咖啡酸 325 肉桂酸 273

儿茶素 278 根皮素 280

香草醛 310

212 流动相选择 据文献报道多酚的高效液相检测多采用甲醇-水、乙腈-水作为流动相[22，23]。由于乙腈的极性大于甲醇，用乙腈作为流动相可以使峰形更加对称，故选择乙腈作为流动相。试验发现仅用乙腈-水做流动相，色谱峰拖尾比较严重，这可能是由于多酚中的酚羟基和羧基易电离使其在固定相上具有双重保留机制，加入少量的酸可以使多酚的电离受到抑制。本试验选用乙酸为酸性调节剂，经过多次试验发现，在流动相中加入1%乙酸可以克服色谱峰拖尾的现象。但由于本试验所测得酚类物质种类较多，极性有差异，采用一般的等度洗脱，分离效果差，故采用梯度洗脱的方法。最终确定梯度洗脱程序为：A相乙腈，B相1%乙酸（0 min，A∶ B =10∶ 90；30 min，A∶ B =35∶ 65；40 min，A∶ B =35∶ 65；42 min，A∶ B =10∶ 90；45 min，A ∶ B =10∶ 90）。

22 标准品分离效果

在已确定的色谱条件下，分别取10 μl标准品混合液进样，得到标准品液相色谱图（图1）。从图1可以看出，各成分保留时间（min）分别为没食子酸3398、绿原酸7915、对羟基苯甲酸9348、表儿茶素10165、咖啡酸10765、儿茶素12565、香草醛15132、阿魏酸17098、苯甲酸21832、根皮苷22932、槲皮素25165、肉桂酸31032和根皮素33765。在确定的色谱条件下13种酚类物质均能得到很好的分离，分离效果佳，峰形较好。

1没食子酸；2绿原酸；3对羟基苯甲酸；4表儿茶素；

5咖啡酸；6儿茶素；7香草醛； 8阿魏酸； 9苯甲酸；

10根皮苷；11槲皮素；12肉桂酸；13根皮素；下图同。

图1 多酚标准品HPLC色谱图

23 标准曲线和检测限测定

配置一系列不同浓度的多酚标准品混合溶液，在确定的色谱条件下进样分析，以峰面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标，绘制曲线进行线性回归，得到各多酚物质的回归方程和相关系数（表2）。根据信噪比RSN=3，测得各组分的最低检测质量浓度。从表2看出，各酚类物质在一定线性范围内的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系，相关系数均大于0999。同时最低检测限表明，此方法可以检测到含量较低的物质。因此该方法可对样品进行准确分析且具有较高的灵敏度。

表2 酚类物质的回归方程、相关系数

及最低检测限

酚类物质 回归方程 相关系数

（R2） 线性范围

（mg/L） 检测限

（mg/L）

没食子酸 Y=126×105X+333×105 09998 20～600 020

绿原酸 Y=203×105X+114×105 09999 20～600 015

对羟基苯甲酸 Y=798×104X-342×104 09994 20～600 017

表儿茶素 Y=551×104X-314×104 09996 20～600 013

咖啡酸 Y=260×105X-216×105 09998 20～600 025

儿茶素 Y=109×104X+185×104 09998 20～600 019

香草醛 Y=399×105X+282×105 09997 20～600 017

阿魏酸 Y=386×105X+819×104 09992 20～600 019

苯甲酸 Y=243×104X-581×104 09995 20～600 022

根皮苷 Y=665×104X-630×104 09999 20～600 016

槲皮素 Y=352×104X-158×105 09999 20～600 027

肉桂酸 Y=418×105X-787×105 09991 20～600 023

根皮素 Y=345×105X-170×104 09999 20～600 022

24 加标回收率和精密度测定

称取两份相同的样品，其中一份加入一定量的多酚标准品，按照“131”的方法进行处理，将两份样品的提取液在相同的条件下进行HPLC分析，利用标准曲线计算出各样品的浓度，根据公式：加标回收率（%）=（实测值-样品的含量）/添加值×100，计算出各组分的加标回收率。同一份样品重复进样5次进行精密度实验，计算各酚类物质的相对标准偏差（RSD）。由表3可知，本方法的回收率在982%～1015%，RSD在10%～25%，精密度高，结果准确。因此，本方法较高的回收率和精确度，可以用于同时测定石榴果实中13种酚类物质的含量。

表3

回收率和精密度的测定

酚类物质 原有量

（mg/L） 加入量

（mg/L） 检出量

（mg/L） 回收率

（%） 相对标准

偏差（%）

没食子酸 632 1000 1621 989 17

绿原酸 841 1000 1819 978 13

对羟基苯甲酸 1713 1000 2728 1015 25

表儿茶素 1922 1000 2913 991 12

咖啡酸 737 1000 1743 1006 12

儿茶素 1719 1000 2703 984 16

香草醛 158 1000 1146 988 19

阿魏酸 975 1000 1957 982 13

苯甲酸 304 1000 1292 988 22

根皮苷 461 1000 1455 994 10

槲皮素 215 1000 1201 986 15

肉桂酸 179 1000 1169 984 19

根皮素 025 1000 1019 994 21

25 果实样品的测定结果

经过前处理得到的待测样品，按照确定的色谱条件，取10 μl进样，得到样品的HPLC图谱（图2～图4）。将样品的HPLC图谱与标准品的HPLC图谱比较表明，在“泰山红”石榴皮和石榴籽中检测到13种多酚类物质，包括没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、表儿茶素、咖啡酸、儿茶素、香草醛、阿魏酸、苯甲酸、根皮苷、槲皮素、肉桂酸、根皮素（ 图2、图3 ）。在石榴汁中检测到上述12种多酚类成分，与石榴皮和石榴籽成分相同，仅表儿茶素未检出（ 图4 ）。无论是石榴皮、石榴籽还是石榴汁，其色谱图中均有较高的色谱峰尚不能确认，可能是安石榴苷、鞣花酸等物质。

图2 石榴皮多酚类物质HPLC色谱图

图3 石榴籽多酚类物质HPLC色谱图

图4 石榴汁多酚类物质HPLC色谱图

依据峰面积与外标法计算各酚类物质的含量，结果见表4。所检测的13种酚类物质成分，石榴皮中的含量（5143 mg/g）显著高于石榴汁（0769 mg/g）和石榴籽（0345 mg/g）。按照植物多酚的结构来分，本试验检测到的酚酸类有没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸。石榴皮中酸性酚类物质中对羟基苯甲酸为主要成分，占酸性酚类物质总量的2862%，其后依次为没食子酸、阿魏酸、绿原酸、咖啡酸、苯甲酸和肉桂酸。石榴汁中的酸性酚类物质占总酚含量的4915%，其中对羟基苯甲酸最高，占酸性酚类物质总量的3201%，阿魏酸含量最低，仅占265%。石榴籽中的酸性酚类物质占总酚含量的3362%，咖啡酸和对羟基苯甲酸共占酸性酚类物质总量的4052%，绿原酸占517%。在石榴果实中检测到的类黄酮类化合物有表儿茶素、儿茶素、香草醛、根皮苷、槲皮素、根皮素。石榴皮含有的类黄酮类物质总量（2250 mg/g）显著高于石榴汁（0391 mg/g）和石榴籽（0229 mg/g），其中石榴皮中表儿茶素和儿茶素的含量较高，占类黄酮类物质总量的8093%，根皮素的含量最低，仅占062%。石榴汁中类黄酮类化合物占总酚含量的5085%，儿茶素为主要的类黄酮类化合物，占3811%，其后依次为根皮苷、槲皮素、根皮素和香草醛。石榴籽中类黄酮类化合物占总酚含量的6638%，而根皮苷则占类黄酮类化合物总量的3275%，香草醛仅占568%。

表4

石榴酚类物质的组分与含量

（mg/g）

酚类物质 石榴皮 石榴籽 石榴汁

没食子酸 0504 0016 0039

绿原酸 0429 0006 0064

对羟基苯甲酸 0828 0021 0121

表儿茶素 0951 0025 -

咖啡酸 0384 0026 0054

儿茶素 0870 0043 0149

香草醛 0071 0013 0027

阿魏酸 0468 0015 0010

苯甲酸 0193 0018 0057

根皮苷 0232 0075 0085

槲皮素 0112 0033 0065

肉桂酸 0086 0014 0033

根皮素 0014 0040 0065

多酚总量 5143 0345 0769

注：“-”表示低于检出限。3 结论

31 建立了利用HPLC测定石榴果实13种酚类物质的方法，采用乙腈–1%乙酸水溶液梯度洗脱（0 min，A∶ B =10∶ 90；30 min，A∶ B =35∶ 65；40 min，A ∶ B =35∶ 65；42 min，A∶ B =10∶ 90；45 min，A∶ B =10∶ 90），流速为11 ml/min，柱温30℃，检测波长280 nm。在此色谱条件下，所测得13种石榴多酚的回收率均在98%以上，RSD在10%～25%之间，该方法能将13种酚类物质很好地分离且测定结果准确可靠。

32 利用优化的测定体系，从石榴皮和石榴籽提取物中检测出13种酚类成分，即没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、表儿茶素、咖啡酸、儿茶素、香草醛、阿魏酸、苯甲酸、根皮苷、槲皮素、肉桂酸、根皮素；石榴汁提取物中检测出上述12种酚类物质，仅表儿茶素未测出。

33 石榴果实不同部位多酚含量不同，其中石榴皮酚类物质的含量最高，石榴汁次之，石榴籽的含量最低。石榴果实中主要的酚类物质为儿茶素和表儿茶素，这与杏中的研究一致[21]。除此之外，对羟基苯甲酸和没食子酸的含量也较高，香草醛和根皮素的含量则较低。参 考 文 献：

[1] 李保印 石榴[M] 北京：中国林业出版社， 2004，1-12

[2] 曲泽洲， 孙云蔚 果树种类论[M] 北京：农业出版社，1990，55-59

[3] Meigarejo P， Manuel Salazar D， Artes F Organic acids and sugars composition of harvested pomegranate fruits [J] European Food Research and Technology， 2000， 211（3）：185-190

[4] 武云亮 石榴资源的开发利用与产业化发展[J] 资源开发与市场， 1999， 15（4）：208-209

[5] 李海霞， 王 钊， 刘延泽 石榴科植物化学成分及药理活性研究进展[J] 中草药， 2002， 33（8）：765-769

[6] 苑兆和， 尹燕雷， 朱丽琴， 等 石榴保健功能研究进展[J] 山东林业科技， 2008， 1： 91-93

[7] Lansky E P， Newman R A Punica granatum （pomegranate） and its potential for prevention and treatment of inflammation and cancer[J] Journal of Ethno Pharmacology， 2007， 109： 177-206

[8] 李云峰， 郭长江， 杨继军， 等 石榴提取物对氧化应激血管内皮细胞保护作用的比较[J] 中国临床康复，2006， 33（10）：81-83

[9] 张立华， 孙晓飞， 张艳霞， 等 石榴花化学成分及生物活性研究进展[J] 山东农业科学，2009，3：33-35， 50

[10] 王志远， 李清彪， 杨翠娴， 等 八种水果中的多酚含量及其抗氧化性[J] 天然产物研究与开发，2007， 19：1040-1043， 1023

[11] Artik N， Cemeroglu B， Murakami H， et al Determination of phenolic compounds in pomegranate juice by HPLC [J] Fruit Process，1998，8（12）：492-499

[12] 刘延泽， 李海霞 石榴皮中的鞣质及多元酚类成分[J] 中草药， 2007， 38（4）：502-504

[13] 李国秀 石榴多酚类物质的分离鉴定和抗氧化活性研究[D] 西安： 陕西师范大学， 2008

[14] 闵 勇，王 洪， 姚立华， 等 石榴籽多酚提取工艺研究[J] 食品科学， 2009， 30（12）：66-68

[15] 王华斌， 包晓玮， 韩海霞， 等 新疆石榴皮多酚提取工艺[J] 食品与机械， 2010， 26（5）： 137-140

[16] Gil M I， Tomas Barberan F A， Hess Pierce B Antioxidant activity of pomegranate juice and its relationship with phenolic composition and processing [J] JAgric & Food Chem， 2000， 48（10）：4581-589

[17] Anand P K， Somaradhya M A Chemical changes and antioxidant activity in pomegranate arils during fruit development [J] Food Chemistry， 2005， 93：319-324

[18] 杜丹丹，李建科 Folin-Ciocalteu比色法测定石榴皮多酚含量条件的优化[J] 西北农林科技大学学报， 2011，39（5）：190-196

[19] 李建科， 李国秀， 赵艳红， 等 石榴皮多酚组成分析及其抗氧化活性[J] 中国农业科学， 2009， 42（11）：4035- 4041

[20] 徐 静， 韦京豫， 郭继芬， 等 石榴汁中部分多酚类物质的分离鉴定[J] 中国食品学报， 2010， 10（1）：190-199

[21] 慈志娟， 陈学森， 张立杰， 等 杏果实酶促褐变机理的研究初报[J]山东农业科学，2006，6：17-19， 25 山 东 农 业 科 学 2012，44（11）：117～120