洱源丛枝瑚杀虫活性组分的GC-MS分析

王大浩等

摘要：洱源丛枝瑚（Ｒａｍａｒｉａ ｅｒｙｕａｎｅｎｓｉｓ）的石油醚萃取物经2次柱层析分离得到对粘虫有较高毒杀活性的组分Ｂ１０３。测定了Ｂ１０３对粘虫３龄幼虫的毒杀活性，在２．６ ｍｇ／ｍＬ剂量下，其２４ ｈ的毒杀效果达１００％。通过ＧＣ－ＭＳ分析表明其中含有３４個化合物，其中相对百分含量较高的化合物包括：反油酸甲酯（４０．０６％）、棕榈酸甲酯（３１．０７％）和硬脂酸甲酯（８．２２％）等。

关键词：洱源丛枝瑚（Ｒａｍａｒｉａ ｅｒｙｕａｎｅｎｓｉｓ）；杀虫活性；ＧＣ－ＭＳ；脂肪酸甲酯

中图分类号：Ｓ４８２．３９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）04－0820-03

高等真菌中含有丰富的杀虫活性物质［１，２］。早期研究表明高等真菌对昆虫表现出明显的拒食及驱避作用［３］，某些高等真菌中的蛋白质也具有明显的杀虫活性［４］。洱源丛枝瑚提取物中因含有丰富的杀虫活性组分而受到人们的重视［５］。本研究在前期研究的基础上，以粘虫３龄幼虫为供试对象，采用活性追踪法分离纯化其石油醚萃取物中杀虫活性组分Ｂ１０３，通过ＧＣ－ＭＳ分析其化学组成。本研究的开展将有助于揭示洱源丛枝瑚中抗菌的活性化合物，为其开发提供借鉴和参考。

１材料与方法

１．１材料

洱源丛枝瑚（Ｒａｍａｒｉａ ｅｒｙｕａｎｅｎｓｉｓ）子实体，购于云南，自然条件下阴干，粉碎后备用。

粘虫（Ｍｙｔｈｉｍｎａ ｓｅｐａｒａｔａ Ｗａｌｋｅｒ．），由西北农林科技大学无公害农药研究服务中心养虫室提供，试验时挑取生长发育状态一致的健康３龄初期幼虫供试。

１．２仪器

ＴＲＡＣＥ ＧＣ ２０００／ＤＳＱ气相色谱质谱联用仪（Ｔｈｅｒｍｏ），Ｗ５０１Ｂ型旋转薄膜蒸发仪（上海申生科技有限公司生产）；层析用石油醚（３０～６０ ℃）、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇等溶剂均为分析纯，购于西安化学试剂厂，层析用硅胶（２００～３００目）购于青岛海洋化工厂

１．３方法

１．３．１柱层析方法对洱源丛枝瑚石油醚萃取物浸膏用玻璃柱（８０ ｍｍ ＩＤ × １ ２００ ｍｍ）进行硅胶（２００～３００目）柱层析分离，以氯仿∶乙酸乙酯（１０∶０，

９∶１，７∶３，６∶４，４∶６，０∶１０，体积比）和甲醇依次洗脱，收集（５００ ｍＬ／馏分），合并Ｒｆ值一致的馏分，得１５部分淋洗液，分别标记为Ｂｎ（ｎ＝各部分淋洗液编号）。采用常压柱层析对Ｂ１部分进行柱层析分离，柱型５０ ｍｍ ＩＤ × ８０ ｍｍ，硅胶２００～３００目，上样量为１５ ｇ，以石油醚∶氯仿（１０∶０，９∶１，４∶１，１∶１，０∶１０，体积比）、氯仿∶乙酸乙酯（９∶１，３∶１，０∶１０，体积比）依次洗脱，收集（２５０ ｍＬ／馏分），合并Ｒｆ值一致的馏分，浓缩，得１３部分淋洗液，标记为Ｂ１０１，Ｂ１０２，Ｂ１０３，Ｂ１０４，Ｂ１０５，Ｂ１０６， Ｂ１０７， Ｂ１０８， Ｂ１０９， Ｂ１０１０， Ｂ１０１１， Ｂ１０１２，Ｂ１０１３。

１．３．２ＧＣ－ＭＳ测定气相色谱条件为：ＤＢ５石英毛细管柱（３０ ｍ × ０．２５ ｍｍ × ０．２５ μｍ），接口温度２５０℃，采用程序升温模式，初始温度为６０ ℃，恒温 ４ ｍｉｎ 后以８℃／ｍｉｎ 升温至２６０℃，恒温 ２０ ｍｉｎ；载气为９９． ９９９％高纯氦气，进样量为１ μＬ；质谱条件：ＥＩ 离子源，电离电压７０ ｅＶ，离子源温度２５０ ℃，扫描范围２０～５００ ｍ／ｚ，扫描速度１ ｓ／１０倍程。ＮＩＳＴ质谱标准库计算机检索确定各成分，采用面积归一化法计算各组分的相对含量。

１．３．３生物活性测定对粘虫的毒杀作用采用小叶碟添加法［６］：将新鲜饲喂叶片剪成１ ｃｍ × ２ ｃｍ大小的叶碟，于供试药液中浸渍２～５ ｓ后自然晾干，同时用各溶剂作对照。在垫有滤纸的培养皿中放入饥饿４ ｈ的试虫，然后放入上述处理叶片。各试虫每处理１０头，重复３次，经２４、４８、７２ ｈ后采用目测法检查各处理试虫死亡数，并计算校正死亡率。死亡标准：虫体失水皱缩，触之不动。触杀活性测定采用点滴法［７］：将供试药剂用丙酮稀释至所需浓度，用微量毛细管（根据需要选择０．０２４～０．９６０ μＬ不同型号）定量点滴施药于试虫幼虫前胸背板，每处理点滴１０头，设３次重复，对照点滴等量丙酮，点滴处理后试虫置于养虫室［Ｔ＝（２５±１）℃，ＲＨ＝７５％±５％，Ｄ／Ｌ＝１２ ｈ／１２ ｈ］饲养，２４ ｈ后采用目测法检查各处理试虫死亡数，并计算校正死亡率。死亡标准同上。

２结果与分析

２．１生物活性测定结果

根据前期生物测定结果，以粘虫３龄幼虫为试虫，采用小叶碟添加法对洱源丛枝瑚石油醚萃取物柱层析Ｂ１分离组分进行生物活性测定，结果见表１。由表１可知，Ｂ１０３组分对粘虫有较高的毒杀活性，２４ ｈ后校正死亡率达到１００％，其他部分对粘虫均无明显的毒杀活性。表明Ｂ１中对粘虫有毒杀活性的成分主要集中在Ｂ１０３部分。

另外，为了进一步明确Ｂ１０３组分对粘虫毒杀活性的作用方式，采用点滴法测定其对粘虫的触杀活性，结果见表２。由表２可知，Ｂ１０３对粘虫的２４ ｈ校正死亡率达４８．２８％，表明Ｂ１０３组分对粘虫有一定的触杀活性。

２．２ＧＣ－ＭＳ分析结果

对ＧＣ－ＭＳ谱图进行检索分析，从Ｂ１０３组分中共鉴定化合物３４个，其中脂肪酸甲酯类化合物２３个，取代苯类化合物５个，烷烃类化合物４个，酮类化合物１个，醇类化合物１个，结果如表３所示。由表３可知，Ｂ１０３部分主要含有脂肪酸甲酯类，取代苯类，烷烃，酮和醇类化合物等，其相对含量分别为９４．６０％、１．２２％、０．７９％、０．１１％和０．１０％。由此推测Ｂ１０３对粘虫有毒杀活性的物质可能为脂肪酸甲酯类化合物。

３结论与讨论

高等真菌中含有的脂肪酸类化合物具有杀线虫作用［８］。国外对脂肪酸类化合物的杀虫活性研究很多，但其防治对象主要是蚜虫和蜘蛛纲害虫，加上其他局限性而未能大范围应用［９］。国内仅见马承铸等研究发现脂肪酸类化合物能渗透和堵塞小菜蛾、豆圆蝽、稻蓟马等昆虫呼吸道并覆盖呼吸细胞表面，造成呼吸系统细胞膜破坏致使虫体丧失正常生理功能，从而导致昆虫死亡［１０］。

本研究分离得到对粘虫具有毒杀作用的Ｂ１０３组分，主要成分为脂肪酸甲酯类化合物，其总的百分含量达到９４．６％，其中含量较高的分别为反油酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、十七烷酸甲酯、亚油酸甲酯、十五烷酸甲酯、木蜡酸甲酯等。后期将主要对其作用致毒症状，致毒方式及致毒机理开展进一步研究。另外，还将从反油酸甲酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、十七烷酸甲酯、亚油酸甲酯、十五烷酸甲酯、木蜡酸甲酯等单一化合物的杀虫活性进行分析，从而确定Ｂ１０３组分中的杀虫活性成分，为揭示这类化合物的作用机理和发现新的作用靶标提供研究基础。

参考文献：

［１］ 高锦明，陈安良，汪玉秀，等． 高等真菌杀虫成分的研究进展［Ｊ］． 西北林学院学报，２００２，１７（２）：６４－６８．

［２］ 王大浩，冯俊涛，陈安良，等． 高等真菌在植物保护中的研究进展［Ｊ］． 中国农学通报，２００５，２１（４）：２４６－２４９．

［３］ ＭＩＥＲ Ｋ Ｓ，ＭＩＥＲ Ｎ Ｄ，ＷＡＮＧ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｆｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍｕｓｈｒｏｏｍ ａｎｄ ｔｏａｄｓｔｏｏｌ ｃａｒｐｏｐｈｏｒｅｓ ［Ｊ］． Ａｃｔａ Ｂｏｔａｎｉｃａ Ｙｕｎｎａｎｉｃａ，１９９８，２０（２）：１９３－１９６．

［４］ ＷＡＮＧ Ｍ， ＶＥＲＯＮＩＱＵＥ Ｔ， ＬＡＵＲＥＮＴ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｕｓｈｒｏｏｍ ｆｒｕｉｔｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］． Ａｃｔａ Ｂｏｔａｎｉｃａ Ｙｕｎｎａｎｉｃａ，２００２，２４（２）：２３５－２４０．

［５］ 王大浩，冯俊涛，陈安良，等．洱源丛枝瑚提取物的化学成分及其杀虫活性初步研究［Ｊ］． 西北农业学报，２００５，１４（５）：１４２－１４５．

［６］ 张兴，赵善欢． 楝科植物对几种害虫的拒食和忌避作用［Ｊ］． 华南农学院学报，１９８３，４（３）：１－７．

［７］ 吴文君． 植物化学保护实验技术导论［Ｍ］．西安：陕西科学技术出版社，１９８８．９３．

［８］ 董锦艳，李国红，张克勤． 真菌杀线虫代谢物的研究进展［Ｊ］．菌物系统，２００１，２０（２）：２８６－２９６．

［９］ 肖洁． 无公害脂肪酸杀虫剂的研究与发展［Ｊ］．农业环境保护，１９９７，１６（５）：２３８－２３９．

［１０］ 马承铸，顾真荣． 脂肪酸类化合物对昆虫致死作用和菜虫田间防治试验［Ｊ］． 上海农业学报，２００３，１９（３）：１０１－１０４．