药渣纤维素降解菌的筛选及酶活测定

郭建军等

摘要：以药渣和羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为碳源，通过平板初筛及多种酶活综合测定复筛，从深层封土、牛粪堆肥等样品中筛选到８株纤维素降解菌，其中菌株ＪＸ９的酶活最高，酶系组成最合理，其Ｃｘ、Ｃｂ、Ｃ１和ＦＰＡ分别达到８２．４１、5.71、15.52和7.64 Ｕ／ｍＬ。

关键词：药渣；纤维素降解菌；筛选；纤维素酶

中图分类号：Ｑ９３－３３１；Ｑ９４６．５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）04－0689-03

江西省现有中成药生产企业近百家，这些企业每年产生近１００万ｔ废弃中药渣，而全国每年产生１ ０００多万ｔ中药残渣［１］。药渣造成大量环境污染的同时也增加了企业处理这些药渣的经济负担，如何有效处理这些药渣的问题已日益突出［２］。药渣主要组分包括纤维素、半纤维素和木质素，其中纤维素是制约药渣降解的重要因素。使用传统的物理化学方法，如酸处理、碱处理以及蒸汽加热等方法处理药渣等，存在反应条件剧烈、设备昂贵、成本较高、带来新的环境污染等问题［１－３］。而利用投加纤维素高效降解菌的方法经济、有效，正逐渐成为当前的研究热点［４］。近年来，国内外对于纤维素降解菌和纤维素酶的报道较多，但大部分研究集中在对秸秆的降解上，对于药渣降解的报道甚少。本研究的目的就是利用以纤维素为惟一碳源的方法从堆肥中初步筛选高效无毒的好氧纤维素降解菌，再从中复筛出较好的菌株，以便开发药渣好氧堆肥的高效微生物菌剂。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１含菌样品２００９年１０月中旬，采集森林中腐化的楠木、长期堆放而腐化的松木以及腐烂的植物下表层湿润肥沃的土壤，采集长期堆放药渣被污染的表层肥沃的土壤以及深层封土、牛粪堆肥等共１０份样品。这１０份样品包括植物样品４份、土壤样品６份。采集样品后立即带回实验室接种，进行富集培养。

１．１．２培养基［５］富集培养基：Ｋ２ＨＰＯ４ ２．０ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．４ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．３ ｇ，ＣａＣｌ２ ０．３ ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ５．０ ｍｇ，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ １．６ ｍｇ，ＺｎＳＯ４ １．７ ｍｇ，ＣｏＣｌ２ ２．０ ｍｇ，药渣粉３０ ｇ，用去离子水定容至１ Ｌ。羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ-Na）固体培养基：ＣＭＣ－Ｎａ １５．０ ｇ，ＮＨ４ＮＯ３ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ ｇ，琼脂２０ ｇ，用去离子水定容至１ Ｌ，ｐＨ自然，１２１ ℃灭菌。纤维素－刚果红固体培养基：ＫＨ２ＰＯ４ ２ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．５ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １ ｇ，琼脂２０ ｇ，刚果红０．２ ｇ，ＣＭＣ－Ｎａ ２０ ｇ，ＮａＣｌ ０．５ ｇ，用去离子水定容至１ Ｌ，ｐＨ自然，１２１℃灭菌。液体产酶培养基：ＣＭＣ－Ｎａ或者药渣２６ ｇ，ＮＨ４ＮＯ３ １．０ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．０ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．５ ｇ，蛋白胨１ ｇ，酵母膏１ ｇ，ｐＨ ７．０～７．５，１２１ ℃灭菌。

１．２方法

１．２．１菌种富集称取菌种来源样品５ ｇ，加入以药渣为惟一碳源的１００ ｍＬ富集培养基中，２８ ℃恒温振荡培养７ ｄ，吸取５ ｍＬ培养液转入新的富集培养基，富集３代。

１．２．２菌种初筛取富集３代的培养液适当稀释，在纤维素-刚果红固体培养基上分离纯化菌种，观察平皿上是否出现水解环以及水解环的大小。同时参考水解环产生的先后和清晰度，初步比较不同菌株的纤维素酶酶活，并确定用于酶活测定的菌株。

１．２．３菌种复筛将分离得到的优势菌株分别接入液体产酶培养基，３７ ℃振荡培养４ ｄ，将发酵液用2层纱布过滤，滤液于４ ℃，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０ ｍｉｎ，上清液即为粗酶液。

１．２．４酶活测定［６，７］采用ＤＮＳ还原糖法测定各纤维素酶酶活。全酶活（ＦＰＡ）的测定：取2支２５ ｍＬ刻度的试管，各加０．２ ｍＬ酶液，再加ｐＨ ４．８的醋酸缓冲液１．８ ｍＬ。测定管加入１ ｃｍ × ６ ｃｍ滤纸条，充分浸泡于（５０.0±０．５）℃恒温水浴６０ ｍｉｎ，空白管同时置（５０.0±０．５）℃恒温水浴６０ ｍｉｎ。然后分别加入ＤＮＳ显色液２ ｍＬ，空白管同时加１ ｃｍ × ６ ｃｍ滤纸条。沸水浴１０ ｍｉｎ，冷却后加水至１５ ｍＬ，以空白管调零点，在５５０ ｎｍ处测ＯＤ值。内切酶酶活（Ｃｘ）的测定：取2支２５ ｍＬ刻度的试管，各加０．２ ｍＬ酶液。测定管加１．８ ｍＬ ＣＭＣ-Na（质量分数１％），空白管只加ｐＨ ４．８的醋酸缓冲液１．８ ｍＬ。然后置（５０.0±０．５）℃恒温水浴６０ ｍｉｎ。再分别加入ＤＮＳ显色液２ ｍＬ。放沸水浴锅反应１０ ｍｉｎ，冷却后加水至１５ ｍＬ，以空白管调零点，在５５０ ｎｍ处测ＯＤ值。外切酶酶活（Ｃ１）测定则只用把ＦＰＡ测定中的滤纸条换成５０ ｍｇ的脱脂棉，β－葡萄糖苷酶酶活（Ｃｂ）测定需把Ｃｘ测定中的ＣＭＣ-Na（质量分数１％）换成水杨素（质量分数１％）。

２結果与分析

２．１菌种初筛结果

将来自于堆放的腐化朽木、腐烂植物及腐烂药渣的肥沃土壤及深层封土等作样品，在以药渣为惟一碳源的培养基中进行３代富集，取其菌液涂布于ＣＭＣ-Na固体培养基中，待其长出菌落后，进行平板划线法分离，分离到一系列纤维素降解菌。然后将分离得到的纤维素降解菌分别接种在纤维素－刚果红固体培养基上观察其生长情况。纤维素降解菌能快速地在纤维素－刚果红固体培养基上产生清亮的水解环，试验表明，其中JX8和ＪＸ９菌株在平板上能较快地产生较大的水解环，图１是ＪＸ８和ＪＸ９在培养基上的水解环，说明它们具有较高的纤维素酶酶活。

２．２菌种复筛结果

纤维素的降解是多酶体系作用的结果，多酶体系包括内切β-1，4葡萄糖苷酶（Ｃｘ酶）、外切β-1，4葡萄糖苷酶（Ｃ１酶）、β－糖苷酶（Ｃｂ酶）３种主要成分。为此选择测定Ｃｘ、Ｃ１、Ｃｂ、ＦＰＡ ４种酶活大小作为菌种的复筛依据。

将菌种分别接入以药渣和ＣＭＣ－Ｎａ为碳源的液体产酶培养基，培养５ ｄ后的酶活测定结果如表１所示。通过对以药渣和ＣＭＣ－Ｎａ为碳源的两种发酵方式进行酶活测定，筛选得到了８株酶系组成各异的菌株。由试验结果可以看出，对于FPA和Ｃｘ，以药渣为碳源的菌ＪＸ９和以ＣＭＣ－Ｎａ为碳源的菌ＪＸ８的较高，且它们的Ｃｘ与其他菌相比差异较大；对于Ｃ１，以药渣为碳源的菌ＳＣ１和以ＣＭＣ－Ｎａ为碳源的菌ＳＣ３的较高；Ｃｂ相对于其他酶活都较低；Ｃ１、Ｃｂ和FPA在菌株之间差异都较小；这些表明菌株ＪＸ８和ＪＸ９降解纤维素的能力比其他菌株要强；酶活测定结果与水解环测定结果基本吻合，进一步验证了用纤维素－刚果红固体培养基平板筛选纤维素降解菌的方法是比较合理可行的。

２．３纤维素降解菌产酶的酶活稳定性测定结果

由上述试验可以看出，菌株ＪＸ８和ＪＸ９的酶活相对较高，说明其分解药渣、ＣＭＣ－Ｎａ的能力比其他菌株要强，因此，选择以药渣为碳源的ＪＸ９菌株和以ＣＭＣ－Ｎａ为碳源的ＪＸ８菌株的发酵液为试验样。在２０～１００ ℃的不同温度下测定其Ｃｘ，如图２所示，两菌株产酶的酶活具有较好的耐高温活性，但菌株ＪＸ９的Ｃｘ一直高于ＪＸ8；图３结果表明，ＪＸ９菌株发酵产酶的酶活在ｐＨ ４～９时都保持较高的活性，相对ＪＸ8更稳定，说明其发酵后产生的酶活具有较好的广谱性，该试验说明菌株JX9相对JX8酶活更高且酶系组成更合理。

３结论与讨论

为了获得尽可能多的优良降解菌，一般采用多种方法对纤维素降解菌进行筛选。本试验采用传统纤维素－刚果红培养基平板法进行初筛和多种纤维素酶活综合测定进行复筛相结合，以防止遗漏优良菌种［８］。筛选得到了８株酶活较高且酶系组成比较合理的菌种，其中ＪＸ９菌的酶活最好，酶系组成也最合理，对其以药渣为碳源的发酵，FPA达7.64 Ｕ／ｍＬ，Ｃx、Ｃｂ和Ｃ１分别为82.41、5.71和15.52 Ｕ／ｍＬ，且其酶活稳定性相对较高，说明了纤维素的降解是多酶体系协同作用的结果，以多种酶指标进行纤维素降解菌的筛选是一种更为有效的筛选方法。

纤维素的生物降解过程涉及到一组复合的纤维素酶，一般认为它包括３种，分别为内切β－１，４葡萄糖苷酶，简称内切酶；外切β－１，４葡萄糖苷酶，简称外切酶；β－糖苷酶，也称纤维二糖酶。纤维素的降解必须依靠３种组分的协同作用才能完成［９］。本试验结果表明，菌株ＪＸ９内切酶酶活高，且稳定性较好，但Ｃ1不如Ｃｘ好。研究表明，内切酶对聚合度高的长链纤维素水解能力强，而β－糖苷酶对短链纤维素类物质如纤维二糖具有很强的水解能力［１０，１１］，Ｃb过低会导致中间产物纤维二糖积累从而阻遏或抑制整个纤维素降解过程［１２，１３］。因此今后的工作中，可筛选Ｃb较高的菌株与ＪＸ９混合发酵，进一步提高ＪＸ９降解纤维素的效率。

今后可以结合药渣降解，进一步加强微生物参与利用纤维素降解生产，这对缓解能源危机及环境污染等问题也具有深远的影响。近年来许多学者认为，纤维素的高效降解与微生物之间的协同作用有一定相关性，这些协同作用包括纤维素降解菌间、纤维素和非纤维素降解菌间的相互作用。张晓昱等［１４］研究发现把真菌与细菌共培养后，其降解纤维素的速率明显高于任何一个单一菌株。但是由于菌种的产酶能力以及酶组分比例协调问题，在纤维素高效降解过程中，多种微生物之间的协同降解仍有待进一步研究。