观赏植物DFR基因的研究进展

符红艳　于晓英　廖祯妮

摘要：从二氢黄酮醇4-还原酶基因结构、基因的进化、基因的表达特性及其在基因工程方面的研究进展进行了概述和总结。

关键词：DFR；基因结构；表达特性；基因进化；基因工程

中图分类号：S188 文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.06.004

1DFR基因在观赏植物的呈色及花色素苷合成途径中的作用

色彩是观赏植物表现出来的一个重要特性，花、叶、果实等这些观赏器官的颜色都决定着观赏植物的观赏价值和商业价值。在高等植物中，花色和果色主要由类黄酮、类胡萝卜素和甜菜色素三大色素所决定[1]。而类黄酮中的花色素苷则是影响花色的主要色素，赋予花和果实除绿色之外的其他颜色，如红色、粉红色、紫罗兰色和蓝色等，特定条件下还出现黑色[2]。

二氢黄酮醇4-还原酶(Dihydroflavonol 4-Reductase，DFR)在不同花色形成过程中发挥了关键作用，它是把二氢黄酮醇转变为花色素反应的第一个酶[3]。类黄酮类色素的生物合成已经较为清楚[3-4](图1)。由苯丙氨酸到花青素的合成可以分为3个阶段:第一阶段由苯丙氨酸到香豆酰CoA,这是许多次生代谢都共有的;第二阶段是由香豆酰CoA到二氢黄酮醇,这是类黄酮代谢的关键反应,它合成花青素和其它黄酮物质；第三阶段是各种花色素苷的合成。

在花色素苷合成的途径中，DFR对花色素苷的最终形成起决定性作用。DFR是花色素苷生物合成中的关键性最初是在紫罗兰的一个突变体中发现的[5]。其反应需要NADPH参与。DFR依赖DHK、DHQ和DHM 3种底物，它们在结构上非常相似，只在B苯环上的轻基数目上不同。DFR能利用这3种底物，是因为F3′H和F3′5′H两种轻化酶的活性。F3′H能使DHK转化成DHQ。F3′5′H则可以让DHK转化为DHM，还可以使DHQ转化为DHM[6]。这是因为不同物种的DFR对底物选择性不同，合成了不同的花色素，就呈现出各异的花色[7]。就如矮牵牛的DFR缺乏还原底物DHK活性，所以其花瓣缺少橙色；而大丁草DFR能还原DHK，其花瓣就能产生橙色[8]。

2二氢黄酮醇4-还原酶基因结构

1985年，OReiny C等[9]采用转座子标签技术，首次从玉米和金鱼草中分离出了DFR基因，1989年Beld等[10]用金鱼草DFR基因作为探针分离出了矮牵牛DFR基因，相关研究者陆续采用同源克隆的方法已在多观赏种植物中分离出了DFR基因（表1）。现有研究结果表明，DFR基因在植物的基因组中一般为单拷贝[5]，其为多基因家族的例子很少。裂叶牵牛（Ipomoeanil）与圆叶牵牛（I.purpurea）的基因组序列包含6个外显子和5个内含子，金鱼草、拟南芥与矮牵牛一样的DFR基因也包含了5个内含子；内含子的剪切位点均符合GT－AG法则[11]。陈大志等[12]在研究唇形亚纲植物DFR基因时表明，DFR表现为亲水性。唇形亚纲植物DFR基因的空间结构分为两个部分为松散C-末端和致密球状结构。DFR与NADPH辅助因子的底物结合区域都在致密球状结构中。唇形亚纲植物DFR都含有一个NADB_Rossmann superfamily保守结构域。

DFR为脱氢酶类，此类酶主要的特点是至少含有2个结构域即，第一个结构域—辅酶的结合位点及第二个结构域—催化作用位点。不同物种其DFR氨基酸序列存在一定区域的同源性，如在DFR与NADP结合位点，‘VTGAAGFIGSWLIMRLLERGY，为高度保守区[13]。DFR对不同底物的结合由其分子中底物结合区氨基酸序列所决定的，这个序列在不同物种中也高度保守。结合区中134位与145位的氨基酸残基就直接影响酶的底物特异性，且大多数物种在134位含天冬氨酸残基(D)或是天冬酞胺残基(N)[14]。在矮牵牛以外的其他以DHK为底物的双子叶植物中，就存在高度保守的145位谷氨酸残基(E) [2]。祝婷等[15]利用DNAMAN软件对苦荞FtDFR和甜荞FeDFR推导的氨基酸序列及同源蛋白进行多序列比对，其发现在DFR蛋白质序列中有一个NADP(H)结合保守区域VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY，且存在一个底物特异性结合的保守区域TVNVEEKQKPVYDETCWSDVDFCRRV。

3二氢黄酮醇4-还原酶基因进化

DFR依照第134位氨基酸残基的不同将其可分为3类[16]：第一类为Asn型DFR，在绝大多种植物DFR中第134位氨基酸残基为天冬酰胺残基(N);第二类为Asp型DFR，其在134位上存在一个天冬氨酸残基(D)，此类DFR不能有效地将DHK还原成无色花葵素，如矮牵牛、番茄和三花龙胆;第三类是DFR的第134位氨基酸残基既不是天冬酰胺和天冬氨酸，又称为非Asn/Asp型DFR，蔓越橘就在此位点为撷氨酸残基(V)。Asn型的DFR在植物界中分布较广，单子叶植物均为Asn型DFR。Asp型DFR仅分布在部分双子叶植物中，而非Asn/Asp型DFR只在少数植物中存在。但由于Asp型和非Asn/Asp型DFR的数量有限，且在进化上分布较远，由此可推测Asp型和非Asn/Asp型DFR有可能由Asn型进化来的[7]。

孙桂平[17]等在对垂丝海棠花色素苷合成基因MhDFR的克隆时指出其MhDFR和苹果(Malus domestica)、葡萄(Vitis vinifera)、西洋梨(Pyrus communis)等树种的DFR序列均有较高的同源性，含有其家族同源基因相似的中央编码区，且具有典型的DFR基因蛋白功能结构域，属于短链的脱氢酶及还原酶(SDR)家族。从序列比对结果的来看，不同树种来源中的DFR具有较高的同源性，说明DFR在基因进化过程中高度保守，同时也暗示DFR在花色素形成过程中起到重要的作用。据报道，植物DFR在第136位氨基酸的变化直接影响其对底物选择的特异性[18]。在双子叶植物中，存在于第136位是天冬氨酸(ASP，D)、天冬酞胺(Asn，N)和非D加型DFR[16]。陈大志[12]在研究唇形亚纲植物时发现其DFR基因间保持着很高的同源性和一致性，存在一定的密码子偏好性，唇形亚纲植物的DFR基因均在各自的有机体中高表达。在唇形亚纲植物DFR基因地进化过程中主要经历了纯化选择性压力，且在进化分支中经历了相同的选择性压力。唇形亚纲植物DFR基因的进化速率不存在显著差异，进化的平均速率为(0.70±0.21) ×l0-9替换数/位点/年。祁银燕等[19]通过聚类分析结果表明，单子叶植物风信子的DFR基因，和单子叶植物的亲缘关系较近。系统进化树体现了DFR在单子叶和双子叶植物之间的区别，从风信子中克隆出来的DFR基因先与鸢尾等单子叶植物聚类合并，最后才和双子叶植物聚类，表明不同物种DFR基因进化程度不同。也有人认为，DFR的趋异可能发生于单子叶和双子叶植物的趋异之后[20]。

4二氢黄酮醇4-还原酶基因的表达特性

4.1表达的部位

不同物种的DFR基因在不同部位与不同发育期的时空表达特性也有所不同[15]。但DFR在不同品种间的表达体现出空间专一性调控，其在花瓣中的表达与CHS和CHI相协调[21]。花序发育过程中, DFR基因在花器官、花冠内和花类型的表达依照品种花色素苷颜色而变化[22]。

Nakatsuka等[23]在研究亚洲百合“Montreux”时发现，DFR在着色的器官如被片、花丝、花药、雌蕊和红色的鳞片中大量表达，而在未着色的茎、叶子和白色的鳞片中均不表达，且DFR的表达量随花的生长发育而增加，在开花期最大量的表达。可见，DFR只在花色苷着色的器官中表达，其基因的表达量与花色苷的产生相一致[24]。Nakatsuka还在对杂种百合花研究发现LHDFR基因控制花器官表达模式，花瓣花青素积累伴随着LHCHSA及LHDFR的表达，CHS和DFR对花被片及花瓣颜色的控制是独立的。James等[25]通过探针标记技术分离克隆了蔓越橘DFR基因且在烟草中成功的表达，且仅在花色素苷着色的器官中表达，与花色素苷的产生相协调[23]。刘娟等[1]认为，DFR基因表达随着花瓣组织的着色进行，其时空表达特性基本上和花朵的着色模式相一致。

Murray等[26]研究发现，幼年期的常春藤在茎和叶柄中都有花色苷积累，此时DFR活性较高；到了成熟阶段，虽体内积累了大量的二氢黄酮醇，却不能合成花色苷，检测后发现此时DFR没有活性。郭晋雅等[24]的研究结果显示，在不同生长时期及同一生长时期的各品种甘薯中，不同器官的DFR活性与其花色苷含量呈显著线性正相关。文樵夫等[27]研究表明DFR在所有观赏海棠叶片中均有表达，与叶色密切相关，叶色越红的品种，其花色苷含量越高。矮牵牛的DFR-A基因在花冠、花药及种子中表达量很高，在胚珠与茎中的表达量相对较少[28]。许志茹等[29]研究表明地被菊DgDFR1和DgDFR2在‘神韵和‘繁星粉两品种的根、茎、叶中均不表达，但在花中特异性表达。郭凤丹等[30]的研究发现，花生DFR在花青素积累较多的果针中大量表达，在黑色种皮种子、深红色种皮种子中的表达量明显高于粉红色和白色种皮种子中的表达量。周琳等[31]通过实时荧光定量PCR分析表明，牡丹DFR基因在花色素大量积累的花瓣中表达量最高，其次是萼片和雄蕊，再次是叶片，在心皮中表达量最低。

在日本裂叶牵牛、矮牵牛和非洲菊中，同一器官仅有一个DFR基因表达，其表达模式十分复杂[11]。矮牵牛中虽有3个DFR基因拷贝（DFRA，DFRB，DFRC），但只有DFRA在花器官中表达[32]；日本裂叶牵牛中也有3个DFR基因拷贝（DFRA，DFRB，DFRC），但仅在DFRB突变发生时会抑制花中的色素合成途径[33]；同时Southern杂交分析表明非洲菊存在多个DFR基因拷贝，但仅GDFR1有催化活性并在花中表达，对其启动子分析表明，它的表达受复杂的调控[34]。百脉根(Lotus japonicus)的基因组中有5个DFR基因,并能产生6个具有功能的mRNA，具有不同的组织特异性 [5]，其DFR1在花、豆荚、茎、根、叶和结节中都表达；DFR2则在除叶以外的其它器官表达；DFR3只在叶和茎中表达；DFR4和DFR5不在结节中表达外，且在根中表达较弱[35]。

4.2影响表达的因素

影响DFR基因表达的因素很多，包括环境因子对的影响，外源化学物质对的影响等等。DFR和CHS都是光调节酶，光的诱导可以提高这些酶的活性，从而促进花色素苷的积累[36]。矮牵牛花在暗培养下的幼蕾期，花色素苷的积累以及CHS和DFR基因的表达均受到明显的限制，随着光强度的增加，花色素苷的积累和相关基因的表达即受到促进[37]。温度对DFR基因的转录也有一定的影响，张学英等[38]指出39/18 ℃(昼/夜)处理玫瑰花3 d，花色素苷含量明显呈下降趋势，CHS和DFR基因转录水平也有所下降。Hasegawa[39]研究了低温诱导下水芹花青素积累及相关基因的表达，表明DFR基因表达特异地受低温的影响，DFR与PAL和CHS表达机制都不同，在低温胁迫中DFR的表达为关键的一步。pH值也影响着DFR的表达，如在矮牵牛中，bHLH类转录因子ANI的突变导致了细胞液泡的pH值升高，并影响了DFR基因的表达，进而抑制了花色素普的合成[40]。

外源化学物质对的影响体现在蔗糖还可以提高DFR和ANS酶的活性[41]。在低Ca2+浓度下DFR基因的表达量不高，随着Ca2+浓度的增加DFR基因的表达量也随之升高[42]。

5DFR基因在花色改良上的应用

世界上第一例通过基因工程技术改变花色的实例是在1987年，Meyer等[43]将玉米DFR的基因导入矮牵牛Rc01突变体，其花色由白色变为淡砖红色。之后，荷兰S&G种子公司将玉米的DFR基因导入了矮牵牛,再将转基因植株自交,培育出了橙色矮牵牛[44]。Tanaka等[45]把从玫瑰花瓣中克隆的DFR基因，转入淡粉红色的矮牵牛中，产生了矮牵牛所缺乏的橙红色的花葵素。Johnson等[14]在研究兰属植物的花时，将兰属DFR基因转入矮牵牛品系中，结果表明兰属的DFR不能有效还原DHK，从而导致花葵素的缺乏。

由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能的研究领域，同时作为一种有效修饰花色的新方法被应用到了观赏植物的呈色调控中[46]。孙颖等[47]在夏瑾上引入反义DFR基因诱导黄酮累积，因为共显色效应而产生了蓝色花卉。2000年，Meyer等[48]将反义DFR基因导入蓝猪耳中，发现转基因株系的花冠花色素苷含量均有减少，产生了多种新花色图案，且冠檐中的花色素含量的减少程度比冠筒大，由于转化植株中DFR基因的钝化，造成了大量黄酮和黄酮醇物质的积累，致使蓝猪耳的花色显得更蓝。One等[49]揭示了通过调控橙酮生物合成途径导致夏瑾产生黄花。抑制内源F3′H或DFR基因，过表达金鱼草C4′GT（查尔酮4′－O－葡糖基转移酶）基因引起金色草素6－O－葡萄糖苷在花瓣上的大量积累。在蓝眼菊的研究中，通过RNAi抑制F3′H并且导入非洲菊DFR基因，也获得了天竺葵色素积累的结果[50]。

此外，通过控制羟基化模式，能表达翠雀素型花青素的转基因康乃馨和玫瑰也获得成功，已被商业化生产[51-52]。导入外源DFR和F3′5′H基因也是产生翠雀素的前提条件。目前在日本商业化生产的转基因蓝色玫瑰含有外源DFR基因，并且同时过表达三色堇F3′5′H和夏瑾花青素5－酰基转移酶基因。近年来，导入翠雀素的紫罗兰和菊花等品种也陆续问世[47]。澳大利亚Florigene公司和日本Sandory公司的研究人员将矮牵牛F3′ 5′ H和DFR基因导入缺乏DFR的白色香石竹，培育出紫色品种“Moon-dust”，现已在2个国家销售，成为第一例上市的转基因花卉[53]。

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