HPLC法测定人参养荣丸中人参皂苷Rb1的含量

麦艳珍,程 怡*,张素方，余秋强，赵菊香，邓妙丽

(1.广州中医药大学，广东 广州 510006；2.广东医学院，广东 湛江 524000)

人参养荣汤出自《三因极一病证方论》，由人参、熟地黄、当归、甘草、白术等14味中药组方而成，具有益气补血、健脾固肾、养心安神的功效。现代医药工作者根据汤剂处方改良生产工艺，制备成丸剂。《中国药典》[1]2010版一部收载人参养荣丸,并对橙皮苷进行含量控制，制定质量标准。由于人参是本处方的君药之一,其有效成分人参皂苷Rb1经现代药理研究[2-3]表明对中枢神经系统、心血管系统、免疫系统以及在抗肿瘤方面都具有改善调节作用，因此本试验建立对方中人参皂苷Rb1的HPLC含量测定方法,完善本制剂的质量标准。

1 仪器与试药

戴安高效液相色谱仪(P680 HPLC Pump,ASI-100 Automated Sample Injector,PDA-100 Photodiode Array Detector,AT-330 Column Heater)，人参养荣丸为市售品(北京同仁堂股份有限公司，规格:9 g/丸)，人参养荣丸阴性样品由本实验室按处方组成及工艺制成缺红参的样品(中药材均由康美药业股份有限公司提供)，人参皂苷Rb1对照品(批号：110704-200318)，购自中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈为色谱纯；水为去离子水；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(30∶70)，流速：1.0 mL/min；柱温35 ℃，检测波长203 nm，进样量10 μL；理论塔板数按人参皂苷Rb1计算不低于3 000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rb1对照品3.50 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1 mL含人参皂苷Rb1 0.35 mg的人参皂苷Rb1溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取本品剪碎成小块，精密称定5.0 g，加入硅藻土1.5 g，研匀，置索氏提取器中，加甲醇60 mL，加热回流提取至提取液近无色，提取液回收甲醇至干，残渣加水30 mL，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20 mL，弃去三氯甲烷液，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用1%氢氧化钠溶液洗涤3次，每次30 mL，再用正丁醇饱和的水洗至中性，回收正丁醇至干，残渣用甲醇溶解，转移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，转移至离心管，离心，过膜，即得。

2.4 阴性样品溶液的制备 取缺人参的自制样品，照2.3项下方法制成阴性样品溶液。

2.5 专属性试验 按上述色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL进样检测，得色谱图(见图1)。结果表明处方中其他成分不干扰人参皂苷Rb1的测定。

图1 人参养荣丸HPLC专属性色谱图

2.6 线性关系考察 在上述色谱条件下，依次精密吸取2. 1项下对照溶液2.0、6.0、10.0、14.0、18.0、22.0 μL，分别进样。以进样量(μg)为横坐标，峰面积积分值(mAU×min)为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性回归方程为Y=4.182 6X-1.208 8(r=0.999 5),结果表明人参皂苷Rb1在0.70～7.70 μg范围内，其峰面积与进样量有良好的线性关系。

2.7 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪测定峰面积，连续测定6次。测定峰面积，计算平均值为13.028，RSD=1.17%(n=6)，结果表明精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号0010012)，在24 h内分别每4h进样1次，每次进样10 μL，测定峰面积，计算平均值为14.242，RSD=0.92%(n=6)，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验 取同一批号的样品(批号0010012)，取样6分，按2.3项下的方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL，测定峰面积，计算平均值为14.238，RSD=2.13%(n=6)，结果表明该方法重现性良好。

2.10 回收率试验 取同一批号(批号0010012)已知含量的样品5 g，各6分，精密称定，每分加1.5 g硅藻土，研匀，分别置索氏提取器中，精密加入甲醇60 mL，回流提取至无色，提取液回收甲醇至干，残渣用水溶解，分别精密加入相当量的人参皂苷Rb1对照品，然后按2.3供试品溶液的制备项下自“用三氯甲烷振摇提取3次”起，继续操作至供试品溶液制备完毕。进样量为10 μL，在上述色谱条件下进样分析，结果平均回收率为98.87%,RSD=0.86%(n=6)。结果表明该方法具有较好的准确度。

2.11 含量测定 制备3批样品的供试品溶液，吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以外标法计算含量，结果0010012、0010061、0010256的人参皂苷Rb1含量分别为1.386、1.368、1.341。RSD分别为1.21%、0.98%、1.23%。

3 讨论

本处方药味较多，成分复杂。笔者曾采用不同的方法制备供试品溶液，结果HPLC色谱图显示对目标峰的干扰太大，分离效果不好。经查阅相关文献[4-6]，进行多次反复试验，证明人参皂苷Rb1在碱性条件下稳定，且样品经碱性溶液洗涤后，能有效除去大部分酸性物质，排除HPLC检测的干扰组分，故确定采用本试验中的供试品溶液制备方法。

[1]中华人民共和国药典委员会.中国药典[S].北京:中国医药科技出版社,2010:438-439.

[2]Shibata S.Chemistry and Cancer preventing activities of ginseng saponins and some related triterpenoid compounds[J].J Korean Med Sci,2001,16 (Suppl):S28-S37.

[3]杨艳平.人参皂苷Rb-1药理作用的研究概述[J].中国药师,2010,13(2):280-281.

[4]Zhao J,Wang D,Duan S,et al.Analysis of fuzhisan and quantitation of baicalin and ginsenoside Rb(1) by HPLC-DAD-ELSD[J].Arch Pharm Res,2009,32(7):989-996.

[5]宋磊,张春娜,郭圣荣,等.人参皂苷Rb-1在胃液和肠液pH下的稳定性考察[J].中国临床药学杂志,2004,3(4):211-213.

[6]南劲松,邱智东.双参片中人参皂苷Rb1,Rg1,Re含量测定[J].吉林中医药,2008,28(9):679-680.