HPLC法测定金钱利胆丸中丹酚酸B的含量

张府君，程永杰，杨兴鑫，李晓妮

（山西医科大学药学院，山西太原030001）

金钱利胆丸是由丹参、金钱子、鸡内金、茵陈、虎杖、大黄、郁金、柴胡、延胡索等药味组成的复方制剂，具有疏肝清热，利胆排石的功效［1］。本品为医院制剂，临床主要用于治疗胆囊结石、胆总管结石、肝内胆管结石等。丹参为该制剂的臣药，具有祛瘀镇痛、活血通经之功效。现代药理研究表明，丹参还具有扩张血管、改善微循环、抗凝血、消血栓、降低血液黏度、抗菌抗炎及提高机体免疫力等作用，其生理活性成分为丹酚酸B和丹参素等［2-3］。为了更有效地控制该制剂的质量，保证临床用药的安全有效，本文采用HPLC法测定金钱利胆丸中丹酚酸B（C36H30O16）的含量，以控制该制剂的质量。该方法操作简便，重复性、准确性均好，可用于该制剂的质量控制。

1 实验材料

1.1 实验仪器

LC-2010A高效液相色谱仪；日本岛津UV-2450型可见紫外分光光度计。

1.2 实验试剂

乙腈、甲醇为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯；丹酚酸B为对照品（含量测定用，编号：111562-200706，按98%计，购于中国药品生物制品检定所）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：采用迪马Kromasil BOD C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）；检测波长为286 nm，流速1.0 mL/min，柱温20℃，进样量20 μL；理论塔板数按丹酚酸B峰计算不低于7000，此条件下丹酚酸B与其他组分能达到基线分离，分离度大于1.5，且阴性对照实验无干扰（见图1）。

2.2 样品制备

2.2.1 对照品溶液的制备［4-5］精密称取丹酚酸B对照品10.01 mg，置50 mL容量瓶中，加75%甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。精密量取1 mL，置20 mL容量瓶中，加10.13 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。精密量取1 mL，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液（每 1 mL 中含丹酚酸 B10.01 μg）。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品5丸，剪碎，混匀，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，称定重量，水浴中加热回流60 min，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方量除去丹参，制得阴性对照制剂，按2.2.1项下提取方法制备阴性样品溶液，即得。

2.3 专属性试验

取“2.2.1”项下的供试品溶液和“2.2.3”项下的阴性样品溶液与对照品溶液在相同的色谱条件下进行测定，由结果可知，供试品色谱呈现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰，且阴性无干扰。结果见图2。

图2 金钱利胆丸高效液相色谱图

2.4 精密度试验

精密吸取丹酚酸B对照品溶液20 μL，重复进样6次，按上述色谱条件测定，考察精密度。结果RSD=1.0%，小于3%。表明本方法精密度良好。

2.5 线性范围考察

精密称取丹酚酸B对照品适量，加75%甲醇制成 0.1268 mg/mL，分别精密进样 1.0 μL、2.0 μL、5.0 μL、10.0 μL、15.0 μL、20.0 μL。依法测定，丹酚酸 B进样量（μg）对峰面积作图，进行线性回归，其回归方程为 Y=1158.533286X+30653.8，r=0.9994。结果表明，丹酚酸B在0.1268 μg～2.536 μg范围内进样量与峰面积之间呈良好线性关系。

2.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液，按上述色谱条件分别于0 h、2 h、6 h、12 h、24 h 进样 5 μL，测得其平均峰面积值的RSD为1.4%，表明供试品溶液中的丹酚酸B在24 h内是稳定的。

2.7 重复性试验

精密称取同一批号的金钱利胆丸样品6份，分别按供试溶液制备方法制成供试品溶液，测定其丹酚酸B的平均含量为022.3 mg/g，其RSD为0.92%，说明此方法重现性良好。

2.8 回收率试验

采用加样回收方法，精密称取已知含量的样品适量，分别加入一定量的丹酚酸B对照品，照2.2.4项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项下方法测定，结果见表1。平均回收率为96.5%，RSD为1.0%

表1 回收率试验结果 （n=6）

2.9 样品的含量测定

分别取4个批号的样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，照拟定的含量测定方法测定其丹酚酸B的含量，求得平均值。结果见表2。

表2 样品中丹酚酸B的含量测定 （n=3）

在平均含量的基础上再下浮20%，故暂定其限度为0.15 mg/g。

3 讨 论

考虑到丹酚酸B为酸性物质，在中性流动相中易发生离解，使含量偏低且拖尾严重，故在流动相中加入少量甲酸，抑制其离解并改善峰形。本实验分别考察了甲醇-乙腈-甲酸-水（27∶8∶2∶63），甲醇-乙腈-甲酸-水（29∶9∶1.5∶60.5），甲醇-乙腈-甲酸-水（28∶9∶1.5∶62.5），甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）等流动相体系，结果发现当流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）时，能显著改善拖尾，丹酚酸 B 约稳定在10.5 min出峰，色谱峰形较好，样品中各峰均能达到很好的分离，阴性对照无干扰。

试验中对供试品的提取方法和提取时间进行了考察。分别采用超声提取60 min与水浴回流提取60 min，样品含量分别为 0.16 mg/g、0.23 mg/g，故选择水浴回流提取60 min。对于提取时间，选择了60 min、90 min、120 min，结果含量测定结果相同，所以采用回流提取60 min。

取丹酚酸B对照品溶液在190 nm～400 nm进行紫外扫描，结果表明丹酚酸B在286 nm处有最大吸收，所以选择286 nm为检测波长。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版（一部）［S］.北京：化学工业出版社，2005：52.

［2］刘艾林，李铭源，王一涛，等.丹参药理学活性物质基础研究现状［J］.中国药学杂志，2007，42（9）：641.

［3］田成旺，张铁军.HPLC法测定丹芩颗粒中黄芩苷和丹酚酸B的含量［J］.药物分析杂志，2008，28（10）：1738-1740.

［4］张化然.HPLC法测定天王补心丸中丹酚酸B的含量［J］.安徽医药，2007，12（6）：19-21.

［5］胡丹，包利苹，张兆静，等.HPLC法测定宁坤养血丸中丹酚酸B的含量［J］.解放军药学学报，2008，12（1）：37.