实验性酒精性肝损伤小鼠血清和肝组织中ACTA及FS的表达水平及其意义

杨 清，李大光，陈 勃，张灵敏，刘 洋，柳忠辉

(1.吉林大学第一医院二部输血科，吉林 长春 130031；2.吉林大学白求恩医学院免疫学教研室，吉林 长春 130021)

激活素A(activin，ACTA)属于TGF-β超家族成员,在初期胚胎形成、神经分化诱导、造血细胞增殖和分化、内分泌中枢垂体性激素分泌等多方面发挥重要作用。ACTA可由巨噬细胞、Th2细胞以及肝实质细胞产生。有研究[1-2]表明：细胞因子在肝纤维化发病机制中具有重要作用，而激活素是新近发现参与肝纤维化形成的细胞因子，其中以ACTA最为重要，其以自分泌、旁分泌的形式作用于肝细胞，导致肝细胞增殖抑制、诱导肝细胞凋亡及促进细胞外基质分泌等，参与肝脏疾病的发生发展过程。卵泡抑素(follistain，FS)具有广泛的组织分布且与激活素具有高亲和力，作为激活素结合蛋白，具有阻断激活素与其受体结合、中和激活素等多方面的生物学活性[3-4]。目前，关于ACTA和FS在酒精性肝病中的作用，国内外尚未见报道。本文作者拟通过探讨ACTA和FS在酒精性肝损伤中的作用，进一步阐明酒精性肝病的发生机制。

1 材料与方法

1.1 动物及模型建立C57雄性小鼠80只，体质量18～22 g，由吉林大学实验动物中心提供。适应性喂养3 d后，随机分为模型组(n=40)和对照组(n=40)。采用酒精灌胃方法制造酒精性肝损伤小鼠模型。选用酒精为北京牛栏山56℃二锅头，每日1次按每只小鼠5 g·kg-1酒精量给予。连续灌胃3 d。对照组小鼠选用蒸馏水连续灌胃3 d。

1.2 指标检测选择小鼠灌胃后24、72、120及168 h 4个时间点，每个时间点分别杀死模型组和对照组小鼠各10只，采集全部血液，37℃水浴30 min，2 000 r·min-1离心15 min，取血清-80℃冻存。其肝组织采用预冷的PBS液100 mL按心脏灌流方法进行清洗，取肝脏在4%多聚甲醛中固定过夜，石蜡切片及抗ACTA及FS染色。结果判定标准：细胞出现棕黄色染色为阳性细胞，无明显染色细胞为阴性。采用ELISA法检测小鼠血清ACTA和FS水平，试剂由武汉博生生物公司提供。采用改良赖氏法测定模型鼠和对照鼠血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平变化，试剂由武汉优尔生科技股份有限公司提供，严格按说明书操作。

2 结 果

2.1 2组小鼠血清ALT、AST、ACTA和FS水平变化各时间点对照组小鼠血清ALT、AST和ACTA水平无明显变化，而模型组小鼠血清ALT、AST和ACTA水平均有不同程度的变化，其中ALT、AST以24 h为最高，ACTA以72 h为最高。模型组小鼠血清ALT、AST和ACTA水平在4个时间点与相应对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。在4个时间点，模型组和对照组小鼠血清FS水平变化无明显差别，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 HE染色结果对照组小鼠肝组织肝小叶结构完整，肝细胞大小均匀、排列整齐，无变性坏死，无淋巴细胞浸润。模型组小鼠末次酒精灌胃后24 h时，肝脏可见明显的点状出血坏死，坏死处可见大量的中性粒细胞及淋巴细胞浸润，局部肝细胞肿胀，胞质疏松；肝组织病变尤以120 h时最为严重，结构紊乱，肝小叶内细胞肿胀，胞质淡染疏松，呈气球样变。见图1(插页一)。

2.3 免疫组织化学染色结果对照组小鼠肝组织中几乎不表达ACTA，而FS表达阳性。模型组小鼠肝组织中ACTA阳性颗粒分布主要位于中央小叶和门静脉周围肝细胞中，并在间质细胞质及其周围也可见其表达。FS在模型组小鼠肝组织表达与对照组比较无明显差异。见图2～4(插页二)。

表1 不同时间点各组小鼠血清中ALT、AST、ACTA 及 FS水平的变化

3 讨 论

激活素是在性腺中发现的双链糖蛋白，属于TGF-β超家族成员。大量研究[5-6]证实：激活素是多功能的生长与分化调控因子，与肝脏疾病发生发展有关。目前研究最多的是ACTA，肝实质细胞和肝星状细胞(HSC)均能产生ACTA，以自分泌，旁分泌的方式作用于自身和周围细胞，参肝细胞活性调节，与肝脏疾病形成关系最为密切。FS又称卵泡休止素，是1987年先后从猪和牛的卵泡液中分离获得的一种新的单链糖蛋白，FS具有广泛的组织分布且与激活素具有高亲和力，作为激活素结合蛋白，具有阻断激活素与其受体结合、中和激活素等多方面的生物学活性。FS作为一种天然拮抗剂参与多种生理、病理功能的调节，在肝纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化等疾病的形成中均具有重要的作用[7-9]。本实验结果表明：正常小鼠肝脏组织低水平表达ACTA和FS，且主要位于肝小叶内门脉区的肝细胞，在肝损伤过程中ACTA表达升高明显，而且在肝细胞损伤区域周围表达最为明显，FS在小鼠肝损伤后无明显变化。因此，在酒精性肝纤维化形成过程中ACTA和FS表达发生了不同的变化。本研究结果显示：酒精性肝损伤时ACTA表达明显增高，在第7天(168 h)时，ACTA水平明显下降，但依然明显高于对照组；模型组小鼠血清ALT和AST水平在各时间点均明显高于相应对照组，以24 h时最高，提示 ACTA水平变化与肝损伤程度相一致。但模型组小鼠血清ALT和AST水平从120 h后又有所升高，这可能与模型鼠肝脏组织免疫反应增强有关，尚待探讨。有研究表明：ACTA可能通过抑制肝实质细胞增生，促进间质细胞分泌细胞外基质(ECM)而参与肝纤维化、肝硬变的形成，FS与激活素结合而阻断激活素生物学效应的发挥,激活素与FS系统调节了肝细胞的正常生长，激活素具有抑制作用，FS通过阻断激活素而发挥促进作用，这种系统的异常影响细胞正常生长，如肝肿瘤细胞系细胞，这些细胞具有无限制生长特性，在这些细胞中常伴有激活素-FS系统改变。在肝细胞癌细胞系HepG-2中的研究证实：这些细胞有激活素受体表达异常，表现为受体类型减少及与激活素亲和力下降，相反FS的分泌无影响[10-14]。本实验中模型组小鼠FS水平似乎略有升高迹象，是否可考虑为FS对ACTA活性增强的抑制性反应，尚需进一步深入研究。本实验结果表明：ACTA在酒精性肝损伤过程中起重要作用，激活素-FS系统失衡可能是酒精性肝病、肝纤维化形成的重要原因。

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