orexin-B细胞及其神经纤维在癫痫模型大鼠癫痫发作不同时间点的变化及其意义

陈福顺，王 卓，王湘庆，郎森阳

(解放军总医院神经内科，北京 100853)

癫痫是由大脑神经元异常放电导致的中枢神经系统功能失常的脑部疾病，具有突然发生、反复发作的特点。目前的抗癫痫药物大多通过降低神经元兴奋性或增加抑制性神经递质起作用。γ-氨基丁酸(GABA)是中枢内重要的抑制性神经递质，多年来癫痫的发生被认为是中枢内GABA抑制作用减弱或缺乏的结果。orexin又称hypocretin，因其首先于1998年在下丘脑发现，并与食欲有关，故命名为食欲素，包括orexin-A和orexin-B(又称为食欲素A型和食欲素B型)，均为orexin前体的分解产物[1-2]，其受体共有2种亚型—orexin1R及orexin2R，广泛分布于整个中枢神经系统[1-5]，此后又发现其与交感神经活动[6]以及睡眠和觉醒状态的调控有关[7-8]，而对于其与癫痫的有关研究，有实验[9]证实orexin能增强GABA电流，也有报道[10]认为反复癫痫发作患者腰穿脑脊液中orexin-A浓度少于非癫痫患者，但有关orexin-B的研究尚未见报道。因此，orexin可能与癫痫的发生或控制有关。目前对于orexin-B在癫痫发作后多时间点变化的研究国内外均未见报道，因此本研究采用海人酸(kainic acid，KA)腹腔注射诱发大鼠癫痫发作，用免疫组化方法检测orexin-B及其神经纤维在不同时间点的变化情况，以阐明orexin-B在癫痫发生中的变化，深化癫痫的发病机制，且为癫痫治疗开拓一个新的领域。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要仪器和试剂成年雄性Wistar大鼠30只，体质量250～300 g，由解放军总医院动物中心提供。冰冻切片机为Lei CA CM1900，Olympus BX53显微镜，KA(编号KA0250)购自Sigma公司，羊抗orexin-B多克隆抗体(编号SC-8071)为Santa Cruz公司产品，超敏即用型二步法(非生物素)检测试剂盒(编号PV-9003)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验动物分组及模型制作本实验符合卫生部实验动物使用与管理指导意见和解放军总医院实验伦理委员会的有关规定。实验大鼠分笼饲养，饲料与水充足供应，自由摄取。动物房室温22℃，湿度20%～30%，12 h-12 h明暗交替。先饲养适应1周后，按动物体重大小编号，随机分为6组，每组5只：①经腹腔注射KA诱发急性癫痫发作后的时间点，按第8小时、1、3、7天，分别分为8 h、1 d、3 d和7 d组；②慢性复发型组为腹腔注射KA诱发癫痫发作之后第7天再用KA(4 mg·kg-1)注射诱发癫痫发作；③正常对照组，腹腔注射等量生理盐水。

1.3 动物行为学观察及癫痫变化强度分级大鼠经腹腔注射KA后，观察其行为学变化，按Racine描述的5级标准进行判断并详细记录：1级，闭眼、竖毛，胡须抖动，嗅、面部抽搐；2级，点头运动、咀嚼运动、沿着面部肌肉痉挛；3级，一侧前肢抬起，轻微阵挛；4级，用后肢站起，伴有两侧前肢的阵挛；5级，站立、双侧前肢阵挛加重，失去平衡跌倒伴全身阵挛[11]。

1.4 动物处死及标本制备大鼠于致痫发作后的8 h、1 d、3 d、7 d、慢性复发相应时间点，以2%戊巴比妥钠(50 mg·kg-1)将大鼠麻醉后，经左心室刺入升主动脉，剪开右心耳，先快速灌注冷PBS 200 mL后，再灌注4%多聚甲醛 0.1 mol、 PBS (pH 7.4,4℃) 250 mL，开颅取脑,固定于上述灌注液中,然后经含15%、20%，30%蔗糖的PBS溶液先后梯度脱水沉底,待脑组织沉底后，取脑组织修块，根据Paxinos大鼠图谱定位神经核团[12]，自对耳线10.70 mm处开始至对耳线2.7 mm止的范围内于冰冻切片机上行厚度为30 μm的冠状位连续切片。分别将切片置于24孔中，每孔为连续的10张，并用冻存液-20℃保护切片。

1.5 orexin-B细胞及其神经纤维的免疫组织化学染色每只动物选取4片切片，选取部位为对耳线5.7～6.7 mm范围内的连续4孔，每孔各取1片。用羊抗鼠多克隆抗体检测orexin-B及其神经纤维在大鼠脑片的表达。具体如下：①EDTA，95℃、15 min，PBST洗片，3 min×3次；②3%H2O2去离子水孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶，PBST洗片，3 min×3次；③滴加10%兔血清，孵育1 h；④滴加一抗羊抗鼠多克隆抗体(1∶1 000，Santa Cruz)，4℃过夜；⑤弃去一抗，PBS洗片,3 min×3次；⑥滴加PV-9003试剂盒Polymer Helper，室温孵育20 min，PBS洗片,3 min×3次；⑦滴加PV-9003试剂盒Poly-HRP anti-Goat IgG，室温孵育20 min，PBS洗片,3 min×3次；⑧DAB显色1 min，终止反应；⑨裱片，自然晾干后，依次脱水透化，中性树胶封片。镜下观察阳性表达部位呈棕黄色。

1.6 图像处理利用图像分析系统对每张免疫组织化学染色切片进行定量分析。免疫组化染色切片经Olympus BX53显微镜在10倍下观察，并以其配备的DP72(Olympus)数码照相机利用Olympus Cell Sens Ver1.2.1图像摄取软件摄取图像，图像像素为5 184×3 456。用Image-Pro Plus图像分析系统定量测定每张切片相应部位的阳性细胞数及神经纤维的累积光密度(IOD)及其测量面积(area,μm2)，求出其平均光密度值(IOD/area)，测量面积截取每张切片相同部位丘脑室旁核处753 185 μm2。

2 结 果

2.1 大鼠行为学观察及处理经腹腔注射KA(71±8) min后，大鼠表现为湿狗样抖动、前肢阵挛，甚至全身阵挛、失去平衡跌倒伴口吐白沫。痫性发作持续30 min后，腹腔注射地西泮(10 mg·kg-1)终止发作。

2.2 免疫阳性细胞分布情况各区组脑组织的多部位免疫组化切片实验表明：orexin-B免疫阳性细胞分布在大鼠下丘脑尤其是下丘脑外侧区和穹窿周围核，但是在海马有可疑的阳性，且在8 h组orexin-B阳性最高，其次是3 d组。见图1(插页一)。

2.3 免疫阳性细胞数对照组和致痫后8 h、1 d、3 d和7 d组以及慢性复发型组orexin-B免疫阳性细胞的数目分别为73.89±46.31、66.26±40.82、67.61±42.58、92.31±46.24、32.75±30.25和77.82±57.28；7 d组与其他各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。其他相邻组间免疫阳性细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)。各区组orexin-B免疫阳性细胞呈现先稍减少后恢复，之后减少再恢复的趋势。各区组orexin-B免疫组化染片结果见图2(插页一)。

2.4 神经纤维的分布免疫组化染色切片检测结果表明：orexin-B免疫反应阳性神经纤维在中枢神经系统分布广泛，在皮层、海马、丘脑、下丘脑、室旁核等等各个部位都有分布。

2.5 orexin-B神经纤维定量对各区组大鼠的丘脑室旁核进行orexin-B免疫反应阳性神经纤维的定量分析，对照组和致痫后8 h、1 d、3 d和7 d组以及慢性复发型组平均光密度值(IOD/area)结果分别为0.040 249 840±0.016 991 212、0.056 693 460±0.033 409 569、0.028 744 460±0.024 347 261、0.055 445 800±0.014 488 519、0.048 517 270±0.0144 987 200和0.039 411 090±0.010 738 182。随着大鼠致痫后时间的变化，orexin-B免疫反应阳性神经纤维平均光密度值变化呈现出先增加后减少，再增加后又减少的变化趋势。1 d组与8 h和3 d组比较差异有统计学意义(P<0.05)，其他相邻组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组免疫组化染色结果见图3(插页一)。

3 讨 论

癫痫是由于兴奋性增加而抑制性减弱导致的高同步化放电，但其具体的发病机制目前尚未明确，只是认为其与中枢内GABA抑制作用减弱或缺乏有关。Martin 等[9]证实：orexin能增强GABA电流，有实验证明了orexin-B是如何兴奋GABA能神经元的，因此本实验探讨了orexin-B与癫痫的关系。orexin-B免疫阳性细胞的分布局限于下丘脑和穹窿周围核，本实验结果显示：orexin-B免疫阳性细胞数呈现为先稍减少后恢复，之后减少再恢复的趋势。揭示癫痫发作后第7天，orexin-B在神经元细胞内量最少，其他相邻组间差异并不显著，而Morales等[13]所做实验中只检测了诱发癫痫后第2天与第4天orexin-B细胞数与对照组相比无显著差异，与本实验中的检测结果相符。orexin-B免疫阳性细胞在海马有可疑的阳性，且在8 h组阳性最高，其次是3 d组，是否意味着在癫痫发作后海马区有该神经元细胞的增多有待进一步探究。orexin-B神经纤维分布广泛，在皮层、海马、丘脑、下丘脑、室旁核等各个部位都有分布，其免疫阳性神经纤维平均光密度值呈现出与其细胞数相反的变化。Morales等[13]的实验表明：orexin-B神经纤维在致痫后第2天比第4天减少，与本实验结果相符合。

结合orexin-B免疫阳性细胞及其神经纤维的检测结果，本实验有2个新发现：①orexin-B细胞数及其神经纤维在大鼠癫痫发生后有变化；②两者之间变化趋势呈现出相反的关系，推测其原因为癫痫发作后，orexin-B物质由神经元内经其神经纤维传递至其受体起作用，这表明其可能参与了癫痫神经元放电和传播的抑制调节作用，通过增加该物质在大脑中的浓度可能有助于癫痫发作的控制。

[致谢：感谢协和医科大学基础研究所药理教研室左萍萍教授及课题组杨楠老师等的帮助与指导。]

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