乙酰肝素酶转录因子在恶性肿瘤中的表达调控

屠佳，陈晓鹏

(皖南医学院弋矶山医院肝胆一科，安徽 芜湖 241001)

乙酰肝素酶(heparanase，HPSE)是目前发现的哺乳动物细胞中唯一能切割细胞外基质中硫酸肝素蛋白多糖侧链—硫酸乙酰肝素的一种葡萄糖醛酸内切酶，在肿瘤的进展过程中发挥着重要作用。HPSE在恶性肿瘤中常有高表达，它主要通过破坏限制肿瘤生长转移的屏障细胞外基质和基底膜、介导细胞粘附、增加癌细胞的侵移能力、影响细胞分化等方式促进肿瘤侵移[1]。作为促进肿瘤进展的重要分子，HPSE表达调控机制就显得尤为重要。要明确HPSE的表达调控，不同来源细胞、不同病理生理状态下起作用的转录因子也不尽相同，但是这些因子都可影响RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ，RNA polⅡ)的活性[2]。本文就恶性肿瘤中HPSE的部分转录因子及诱导因素的调控机制进行综述。

1 早期生长反应基因 (early growth response-1，EGR1)

EGR1能够针对各种细胞信号(包括生长因子、细胞因子、血管内皮损伤及缺氧)作出反应，并在T淋巴细胞和一些肿瘤组织中参与HPSE mRNA 的表达调控[3]。它是具有锌指结构的转录因子家族成员之一，早期即可对多种信号产生反应而表达增加。在HPSE的基因转录启动子中有一个长约280 bp的区域为高效诱导区，包含两个EGR1结合位点。在T细胞和一些肿瘤细胞中EGR1的过表达，可与上述位点结合，激活HPSE的基因转录启动子，从而诱导肿瘤细胞中的HPSE蛋白表达以及酶活性增强[4]。Zheng等[5]对150例胃癌研究发现胃癌细胞中EGR1诱导肝素酶的表达，其研究结果还表明EGR1和HPSE是相互表达调节的。Ogishima等[6]对50例膀胱细胞癌和正常膀胱组织对比研究发现HPSE表达是由于结合启动子甲基化和EGR1表达调控的，而且这是首次研究证明，在膀胱癌中肝素酶的表达增加是由于启动子甲基化和转录因子EGR1。以上研究均提示 EGR1是调节HPSE表达的重要转录因。

2 ETs家族因子与雌激素

越来越多的研究显示，HPSE在乳腺癌中的表达可被转录因子ETs家族和雌激素及其受体调控。HPSE在乳腺癌侵袭转移中受多种机制调控，主要有：雌激素与其受体结合后作用于HPSE基因特定区域，从而提高HPSE转录活性，增强其基因和蛋白的表达；HPSE可使破骨细胞刺激因子产生增加，从而导致骨质溶解破坏，为乳腺癌骨转移奠定基础；HPSE诱导循环淋巴细胞产生刺激因子，从而促进乳腺癌的侵袭转移[7]。Cohen等[8]用逆转录PCR和Western blot分析相结合的组织芯片证实了HPSE的启动子具有4个雌激素反应元件，后发现在雌激素受体(estrogen receptor，ER)阳性的MCF-7细胞，给予雌激素处理后，HPSE启动子的转录活性明显增强，而ER的中和抗体则可以阻断此效应，但在ER阴性的乳腺癌细胞系中却不出现类似结果，这说明 HPSE启动子的活性可通过经典的雌激素受体途径调控。

ETs在乳腺癌细胞中对HPSE的调节主要是由于HPSE启动子区包含4个ETs结合序列，分别可结合不同的ETs家族成员，分别为PEA3、ER81、ETs1、ETs2，其中前2个为无功能位点，而后2个(ETs1和ETs2)对外源加入的ETs反应明显，具有明显的调控功能，此两位点的突变可导致ETs调控HPSE表达的缺失，显性负向的ETs转录因子也不能活化HPSE的启动子[9]。这些结果都说明ETs转录因子可通过调控HPSE表达，促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。

3 核因子κB(nuclear factor-kappa B)

NF-κB作为细胞内较为下游的转录因子，该因子在肿瘤细胞中也可调控HPSE的表达。有研究以NF-κB信号通路缺陷的肺泡癌细胞系为研究对象，发现NF-κB信号通路的阻断可诱导多种与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)重塑相关的蛋白酶表达下调，其中包括HPSE[10]。另外Wu等[11]用RT-PCR和Western blot技术检测到在缺氧条件下可激活的NF-κB依赖性HPSE的表达，另一项通过对45例胃癌标本的免疫组化和电泳迁移率分析检测NF-κB的活化情况，同时应用半定量RT-PCR检测HPSE的表达，结果发现NF-κB的活化与HPSE的表达水平关系密切，提示NF-κB可通过调节HPSE等蛋白的表达，以控制胃癌的恶性表型[12]。NF-κB通过何种机制调控 HPSE仍不明确，但对 HPSE表达的影响是客观存在的。

4 Sp1和GA结合蛋白(GA-binding protein，GABP)

Sp1结合在GC盒，截断和突变 Sp1位点可大大降低启动子活性，将 Sp1与HPSE启动子共转染可以加强启动子相连的报告基因的表达。在正常上皮细胞可检测到Sp1的存在，但HPSE基因却呈现不表达或低表达，可能是由于其转录后修饰或其启动子区甲基化程度不同造成的。Sp3与Sp1同属于一个核转录因子家族，将Sp3与GABP共转染SL-2细胞，可以上调HPSE基因的表达[13]。

GABP结合于两个以GGAA为核心的序列，近端结合位点与转录起始位点相邻，提示此GABP结合位点可能在转录起始过程中起重要作用。GABP结合位点的突变明显减少了HPSE启动子的活性，进一步证明此结合位点是启动子的重要组成部分，在基因表达调控中起关键作用[14]。王巧欢等[15]分析正常乳腺组织和浸润性导管癌中HPSE和GA结合蛋白的表达，用免疫组织化学方法检测HPSE及GABPα的表达，发现在乳腺癌组织中，HPA与GABP的表达均存在异常，提示HPA和GABP在乳腺癌的发生发展、浸润转移中可能存在重要的协同作用。

5 组蛋白修饰和启动子DNA甲基化

越来越多研究提示，DNA 的甲基化亦是 HPSE启动子活性的重要抑制因素。最初，Shteper等[16]运用甲基化特异性PCR对22个肿瘤细胞系HPSE的启动子甲基化状态进行了检测，发现这些细胞系HPSE启动子存在广泛的CpG岛的甲基化位点，且与 HPSE的启动子活化状态呈负相关，而给予这些细胞系脱甲基药物后，可出现浓度和剂量依赖性的HPSE蛋白、mRNA 和活性增加。另外Hong等[17]研究表观遗传学，如DNA甲基化，组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化可调控HPSE在神经母细胞瘤的表达，发现在3个神经母细胞瘤细之间HPSE启动子有不同的甲基化。他们得出结论是HPSE的表达与组蛋白修饰和启动子DNA甲基化在控制基因沉默的作用，HPSE和NF-κB P65的过度表达可能是过多的组蛋白修饰的结果。

6 p53基因

有学者发现 p53可与HPSE启动子的相关基序结合，并参与其表达调控。p53 是抑癌因子中较为关键的蛋白之一，野生型 p53 作为具有抑癌功能的转录因子，可限制多种应激因素引起的过度细胞生长，如DNA损伤、癌基因的活化、组织缺氧以及细胞间接触的消失等[18]。该研究应用组蛋白免疫沉淀分析方法(chromatin immunoprecipitation，ChIP)，提示野生型 p53与HPSE启动子基序结合后，可抑制其活性，突变型 p53(H175R)不但不产生此抑制效应，甚至对其启动子有活化的作用；而在不同的细胞系中，野生型 p53 的去除或活性的抑制均可导致HPSE表达和酶活性的明显增高；该研究还进一步说明，曲古菌素 A(trichostatin A，TSA)可去除野生型 p53 对 HPSE启动子的抑制效应，它是一种组蛋白去乙酰酶抑制剂，提示p53 通过组蛋白脱酰基作用调控HPSE的表达[19]。该研究虽然提出了p53参与HPSE启动子表达调控的关系，但其具体机制仍需进一步研究。

7 神经营养因子受体

神经营养因子由一系列在功能和结构上与中枢神经系统发育密切相关的营养因子和生长因子组成。这种神经营养因子对HPSE的表达调控主要是与两种不同的受体相结合而发挥作用：一种是酪氨酸激酶受体(tyrosine kinases，Trk)，主要包括TrkA、TrkB、TrkC等3种；另一种是肿瘤坏死因子样受体。Marchetti等[20]对髓母细胞瘤研究中发现，神经营养因子可通过与上述两种神经营养因子受体结合，提高肿瘤组织中HPSE表达及活性，增强髓母细胞瘤的侵袭性，协助其颅内转移。

8 葡萄糖

有关研究表明肾小管上皮细胞在高糖环境中HPSE mRNA 和蛋白的表达显著升高[21]。这可能由于HPSE 基因启动子活性区存在葡萄糖反应元件。当细胞处于高糖环境时，该反应元件被激活，诱导细胞中的HPSE mRNA 及蛋白表达升高。但是，这种诱导作用可被胰岛素和肝素所抑制。此外，细胞外微环境中的葡萄糖含量升高也可能激活一些转录因子(如EGR1、Sp1和Ets启动子家族等)，从而增加细胞HPSE mRNA的表达。所以细胞外微环境中的葡萄糖含量对HPSE的表达影响很大。

综上所述，HPSE的表达调控是多因素、多因子、多层次共同作用完成的，而这些因素和因子又不可避免地参与了肿瘤细胞内其它信号转导网络，从而使整个肿瘤细胞具有转移、侵袭、抗凋亡、血管形成等诸多恶性特质[22]，明确恶性肿瘤HPSE的表达调控机制对以其为靶点的治疗进展将产生事半功倍的效果。因此，探讨恶性肿瘤中HPSE表达调控机制，力求从上游抑制HPSE的表达和活性，已成为治疗恶性肿瘤的新型策略之一。

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