HBV逆转录酶区181位点变异研究进展

李平 综述 汪茂荣 审校

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染呈世界流行，每年约有100万人死于HBV相关的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌，已成为一个严重的公共卫生问题[1，2]。核苷（酸）类药物（Nucleos/tide analogues）是目前治疗慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）的重要药物，具有抑制病毒迅速、作用效果明显、使用方便和不良反应少等特点，但是大多接受核苷（酸）类药物治疗的患者难以在短期内达到持久应答，而且随着治疗时间的延长，HBV易产生变异耐药，造成抗病毒治疗的失败。随着核苷（酸）类药物种类的增加，可通过联合或替代的方法挽救变异耐药，但是位于逆转录酶（reverse transcriptase，RT）区B亚区第181位氨基酸的变异给抗病毒治疗提出了一个新的“挑战”，因为其变异后不仅仅对阿德福韦产生耐药，而且对拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦的药物敏感性均呈现下降，是一个交叉核苷和核苷酸两类药物的耐药位点[3]。

一、rt181变异的概念

野生型HBV rt181位氨基酸是丙氨酸（Ala，A），编码的碱基为GCT。rt181变异主要有两种模式：当编码密码子第一位碱基的G突变为A后，氨基酸变异为苏氨酸（Thr，T），可写作rtA181T；而当编码第二位碱基的C突变为T后，丙氨酸则变异为缬氨酸（Val，V），可写作rtA181V。由于HBV聚合酶基因和表面抗原基因存在部分重叠区域，RT区的变异也引起S区的改变，rtA181T变异可导致S蛋白第172位色氨酸（Trp，W）变异为终止密码子，写作sW172*；或者置换变异为亮氨酸（Leu，L），写作sW172L。而rtA181V变异则导致S蛋白第173位氨基酸由亮氨酸（Leu，L）变异为苯丙氨酸（Phe，F），写作 sL173F。

二、rt181变异的产生

台湾学者Yeh等[4]最早报道了rt181变异，其对23例拉米夫定治疗耐药的患者进行分析，其中有3位患者体内HBV没有出现常见的YMDD（M552I/V）变异，而是出现了A529T（rtA181T）变异，他们进一步用定点突变的方法在体外证明了rtA181T变异株对拉米夫定耐药。2004年Chien[5]等也报道在接受拉米夫治疗的CHB患者中，有1例患者出现了A529T（rtA181T）变异，并且在停药1年后还能检测到该变异的存在。2006年，法国学者Gerolami等[6]报道在2例接受拉米夫定治疗的患者中，出现rt181的另一种变异模式，即rtA181V变异。

一项关于阿德福韦的多中心随机双盲对照研究发现[7]，185例患者经过144周的治疗后，除了3例出现rtN236T变异外，另有3例患者出现rtA181V耐药变异。Yeon等[8]给67例拉米夫定耐药的患者换用阿德福韦治疗，治疗7周后，有2例患者在出现rtA181T变异；治疗12周后，有5例患者出现rtA181V变异。在替比夫定治疗的患者中，也同样发现rt181位点的变异的存在。替比夫定Ⅲ期全球注册的临床研究结果提示[9]，在治疗52周HBV DNA阳性的115名患者中，有16人出现rt181位点的变异。而在恩替卡韦初始治疗的患者中，国内302医院赵攀等[10]对5例HBV rtA181T/V变异患者的临床资料进行回顾性调查和随访后认为：rtA181T/V变异的产生与恩替卡韦治疗无关，其变异为自然产生。Warner等[11]对SeqHepB数据库中患者资料进行分析后发现，在未接受任何抗病毒治疗的患者中可检测到rtA181T变异的存在。

三、变异的临床特点

（一）变异发生率 rt181变异的发生率在不同研究中的比例略有区别。澳大利亚的SeqHepB数据库中统计资料显示[11]：在拉米夫定治疗变异的患者中，rtA181T比例为2%；在阿德福韦治疗变异的患者中，rtA181T比例为18%，rtA181V的比例达到50%。而在未接受抗病毒治疗的患者中，rtA181T出现的概率为0.2%。国内徐东平等[12]对340例CHB患者体内HBV进行耐药分析，其中rtA181T变异检出率3.2%，rtA181V检出率0.3%，rtA181T/V/I检出率0.6%。国内另一篇文献[13]对85例CHB患者的HBV测序后发现，有2例患者发生rtA181T变异，2例rtA181V变异，1例rtA181S变异。

（二）变异的组合 和rt204变异一样，rt181变异既可单独存在，又可与其他变异同时存在，不同变异可存在于同一株病毒株上，也可分别存在于不同的病毒株。对rt181变异患者的HBV的RT区序列进行克隆分析，发现rtA181T/V变异可单独存在，也可与 N236T、M204V/I、N236+N238T、L80V、L80V+M204I等变异同时存在[14，15]。

四、变异的生物学特点

（一）复制特性 HBV DNA变异后对于病毒复制能力的影响是多种多样的，可降低其复制能力，可提高其复制能力，或没有影响。在rt181变异的研究中，大部分学者认为rtA181T变异后，HBV复制能力下降。Yeh等[4]最早发现rtA181T变异的同时，在体外构建突变株，转染细胞后检测复制产物，实验发现，rtA181T变异病毒的复制活性比野生型下降了约88%。Warner等[11]构建rtA181T突变质粒转染到Huh 7细胞后，他们发现细胞内的复制中间体明显减少，而在细胞培养上清中检测不到HBV DNA。Yatsuji等[16]通过构建1.4拷贝的HBV rtA181T突变株转染HepG2细胞后，他们发现HBV DNA水平下降了约20%。关于rtA181V变异对复制的影响，只有李新艳等[17]学者将临床分离的rtA181V变异株转染细胞后，发现HBV DNA水平与野生型相比并未见明显差异。而韩国学者[18]将rtA181T/V变异患者的临床数据进行比较，他们将13例rtA181T/V变异患者与9例rt181未变异者配对后认为，两组患者在HBV DNA水平并没有表现出差异。国内有学者将rtM204位点单独突变与rtM204+rtA181T突变患者两者进行比较，发现引起他们变异所用的核苷酸药物不同，但两者病毒学水平无明显差异[19]，而对rtN236T变异患者与rtA181T变异患者进行比较后，发现两组患者的HBV DNA水平也没有显著差异[20]。

（二）表面抗原（HBsAg）表达 rtA181T/sW172*变异后，会导致HbsAg合成出现缺陷且引起分泌障碍。Warner等[11]研究发现，由于该变异提前出现终止密码子，可使HBsAg截短约55个氨基酸，随后他们利用Western证实了HBV变异株的表面蛋白减小了6kD；而Western检测同时发现转染变异病毒的Huh7细胞内HBsAg含量明显下降，细胞外HBsAg检测不到。他们进一步通过免疫组化染色发现，rtA181T/sW172*变异后的HBsAg在细胞浆内大量聚集，不能正常分泌到细胞外。尽管在体外研究中证实HBsAg分泌缺陷，但在临床上，发生rtAl81T变异患者的血清HBsAg滴度与未变异者并无明显差异[18]。其可能的原因是：患者体内的病毒群是混合的，即同时存在非变异毒株，这些毒株所产生的非变异型HBsAg可以装配变异的HBV，并纠正分泌缺陷。Warner等[11]按不同比例转染变异株和未变异株质粒，随着未变异株质粒所占比例的增加，HBV分泌缺陷能够被逐渐挽救。国内研究也发现，当rtAl81非变异株占10%时，即可在细胞培养上清液中检测到HBsAg表达，且随着非变异株所占比例增加，HBsAg表达也逐步增加，表明rtAl81T/sWl72＊变异株导致的HBsAg分泌缺陷已被rtl81非变异株纠正[17]。

（三）药物敏感性 药物敏感性通常用半数有效浓度（EC50）或半数抑制浓度（IC50）来评价，其原理是定点突变或从体内分离出变异的病毒株，转染细胞后，再加入不同浓度的核苷（酸）类似物，培养一段时间后检测HBV复制情况，并与野生株病毒的EC50/IC50比较，判断耐药性。目前体外实验结果提示，rtA181T/V变异病毒对大部分核苷（酸）类药物均呈现一定程度的耐药性。Villet等[14]实验结果提示，rtA181T变异病毒对拉米夫定、阿德福韦、替诺福韦的药物敏感性分别下降了5.7～10.8倍，2.1～4.5倍，2～2.9倍；rtA181V变异病毒则分别下降了 1.5～7.7倍，2.4～7.8倍，1.2～3.2倍；而 rtA181T或 rtA181V变异病毒对恩替卡韦的敏感性改变尚不明显。他们研究还发现，当出现rtA181T/V联合rtN236T变异后，耐药性较rtA181T/V单点变异明显上升。而有学者等[21]研究发现，rtA181V变异病毒株对阿德福韦、替诺福韦的敏感性分别降低了4.2倍和3倍；但对拉米夫定、恩替卡韦和恩曲他滨的敏感性降低12～15倍，对其他核苷类似物，包括克来夫定、替比夫定、L-dC、L-dA则呈现完全交叉耐药（敏感性下降＞80倍）。

（四）与肿瘤关系 台湾学者Lai等[22]对一位39岁的血清HBeAg阳性，而HBsAg阴性的肝癌患者进行研究，发现其HBsAg阴转是由于体内HBV出现了rtA181T/sW172*变异。他们进行体外研究发现rtA181T/sW172*变异能够转录激活猿猴空泡病毒40（SV 40）和癌基因c-Myc，从而促使肿瘤的发生。而他们利用裸鼠进行的动物实验结果提示，rtA181T/sW172*变异的细胞可在裸鼠体内促使肿瘤的形成。国内[23]也报道：rtA181T/sW172*变异后，HBsAg的分泌缺陷导致蛋白在内质网中堆积，可激活内质网信号通路grp78基因，从而诱使肝癌的发生。

五、rt181变异的对策

目前尚无临床试验对HBV rt181耐药患者的治疗方法进行评价，仅有一些临床治疗的经验报道。有研究[21]报道，接受阿德福韦治疗产生rtAl81V变异的患者，改用或加用拉米夫定能使HBV DNA降低2-3个logl0 copies/ml，但并不能完全抑制HBV复制。他们认为rtAl81V变异病毒对替诺福韦敏感性改变最少。但是Patterson等[24]通过96周的随访发现，TDF治疗rtA181T/V变异患者的抑制病毒能力明显下降，尤其是rtA181V合并rtN236T同时变异时，突变株能使TDF抗病毒活性下降10倍以上。Kurashige等[25]报道1位e抗原阳性，HBV DNA大于7.6 log10copies/ml的患者，在接受拉米夫定治疗后，出现rtA181T变异，当换用恩替卡韦后，病毒量起初略有下降，随后即出现反弹，而此时耐药转为rtM204V+L180M+S202G变异，当联用拉米夫定和阿德福韦后，rtA181T变异再次成为主要变异；最后联用恩替卡韦和阿德福韦后，病毒降到了3.7 log10 copies/ml。他们认为恩替卡韦和阿德福韦联用，能最大程度控制rtA181T和rtM204V的相关耐药。而一些个案报道[26]认为，rtA181T/V变异的患者，换用恩替卡韦治疗后，能够有效抑制病毒复制。目前EASL建议[27]这些发生rtA181T/V变异的患者，给予其加用恩替卡韦，或者使用替诺福韦联合恩曲他滨，但是在临床上能否有效抑制反弹的变异病毒，目前还有待进一步的观察和随访。

六、结语

核苷（酸）类药物通过与HBV DNA聚合酶的自然底物dNTP竞争，而抑制HBV复制。在药物或免疫的长期压力下，在HBV复制过程中（尤其在逆转录过程中），由于聚合酶缺乏严格校正机制，HBV聚合酶区会出现较高频率的变异，相应氨基酸序列改变后影响到空间结构，导致核苷（酸）类药物与聚合酶结合能力明显降低，便发生了耐药现象。当前除恩替卡韦以外的核苷（酸）药物几乎均可导致rt181变异的产生。虽然其变异后病毒缺陷，病毒量不会大幅度的反弹，HBsAg、ALT的水平也没有明显改变[28]。但由于其交叉核苷和核苷酸耐药，对即将在国内上市的替诺福韦亦不敏感，因此给临床长远的治疗用药带来困难。

在临床工作中，我们在努力寻找耐药变异对策的同时，更应做好耐药的预防工作。对于需要长期抗病毒治疗的患者来说，可选用抑制HBV能力强、耐药发生率低的药物；或选择核苷与核苷酸类药物联合用药，以减少或延缓耐药性的发生。

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