血清中17α-羟孕酮的测定方法及其研究进展*

周剑 ，戴新华 ，李红梅 ，弓爱君

(1.北京科技大学化学与生物工程学院，北京 100083； 2.中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所，北京 100013)

血清中17α-羟孕酮的测定方法及其研究进展*

周剑1，2，戴新华2，李红梅2，弓爱君1

(1.北京科技大学化学与生物工程学院，北京 100083； 2.中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所，北京 100013)

阐述了17α-羟孕酮的检测在临床诊断研究方面的重要意义，综述了血清中17α-羟孕酮的检测方法及其研究进展。

血清17α-羟孕酮；免疫法；高效液相色谱法；同位素稀释质谱法

17α-羟孕酮（C21H30O3）是在合成糖皮质激素和性类固醇过程中产生的一种C-21内源性孕激素，可以在17α-羟化酶作用下由孕酮转化，或者在3β-羟类固醇脱氢酶（3β-HSD）作用下由17α-羟孕烯醇酮转化，主要产生于肾上腺皮质，部分产生于性腺。血清中的17α-羟孕酮主要与性激素共同作用，促进个体器官的发育。育龄女性正常值为：卵泡期0.1～0.8 ng／mL，黄体期 0.27～2.9 ng／mL，妊娠末3个月2～12 ng／mL ；男性正常值为 0.31～2.13 ng／mL［1，2］。

血清中17α-OHP的测量是诊断因21-羟化酶缺乏所引起的先天性肾上腺皮质增生症（CAH）的主要手段［3-5］。先天性肾上腺皮质增生症（CAH）代表常染色体隐性激素的紊乱，这种紊乱主要是由于人体内不同酶的缺乏导致，这些酶的缺乏影响人体内合成氢化可的松和甾体激素，增加了17α-羟孕酮和雄激素的分泌，而先天性肾上腺增生90%以上是因为21-羟化酶的缺失［6］。21-羟化酶缺乏的先天性肾上腺皮质增生患者血清中17α-羟孕酮浓度明显升高，11-羟化酶缺乏时，17α-羟孕酮上升幅度较小［7，8］。约 6% 的成年多毛女性有不同程度的21-羟化酶缺乏，这一类迟发型缺乏症病例中17α-羟孕酮浓度常超过卵泡期的高限0.9 ng／mL。17α-羟孕酮的测定也用于分析男性和女性的普通痤疮、男性秃顶及一些不明原因的不育症［9］。

1 血清中17α-羟孕酮的测定方法

关于血清中17α-羟孕酮的研究开始于20世纪50年代，开始只是关注其在人体内的反应和作用，对于血清中17α-羟孕酮检测的广泛研究始于20世纪六七十年代，开始时采用免疫的方法主要为超微分析系统（ultra micro analytic system）和超微的酶联免疫法(ELISA)，在此基础上又发展了放射免疫法（radioimmunoassay）和时间分辨荧光免疫法（time-resolved fluoroimmunoassay），后来又开发了液相方法、气相色谱质谱法和液相色谱-质谱法等。

1.1 放射免疫法(RIA)

大部分的分析方法都需要用有机溶剂萃取或者用柱色谱分离，然后用RIA分析，需要采用氘标记的17α-羟孕酮或其它标记激素作为示踪标记物。Jndsay. F. Hotman等开发了一个直接固相放射免疫法，不使用萃取和离心的步骤，只需添加两种有机溶剂，该方法能在24 h内分析1 200个样品。新西兰临床生物化学中心的K. H. James Yeo等在1984年就发表了关于血清中17α-羟孕酮检测的放射免疫方法，他们主要采用甲苯和正己烷的混合溶液进行简单萃取，然后以125I作为示踪物，以兔血清为抗体直接进行RIA分析，日间和日内标准偏差分别小于15%和小于10%，灵敏度能达到3 pg，分析回收率达到93.5%（RSD=1.6%，n=15）。分析用时约3 h，比以3H为示踪物更加快速，而且实验成本大为降低［10］。大部分主要的甾类激素都能够在唾液中呈现，研究表明其浓度与人体血清中的浓度存在一定的联系，所以有时在血清样品中难以取得时，唾液中激素的检测也能起到积极的作用，但由于唾液中激素含量相对较低，这就要求特异性好和灵敏度更高的放射免疫分析法，比利时的J. Bourque等研究了人体唾液中孕激素（主要是孕酮）的检测方法，他们将融化的唾液样品与标准品、标记激素和稀释的抗体血清混合，涡旋，37℃培育30 min，然后4℃过夜，在冰浴中将激素按是否结合标记分离，进行RIA测定，该方法的日间和日内不确定度均小于10%，回收率为90%～100%［11］。为了检测更低浓度唾液和血清中的17α-羟孕酮，希腊佩特雷医学院内分泌科的Panagiotis. G. Mylonas等采用与J. Bourque等相同的抗体和孵化方法，增加了10倍样品量和孵化时间以提高灵敏度，实验测定了64个健康志愿者的唾液和血清样品，分成4个组别分离处理后直接进行RIA测定，唾液中和血清中17α-OHP含量的关联性r2在0.62～0.77之间，实验证明该方法能很好地检测唾液和血清中的低浓度17α-羟孕酮［12］。

1.2 酶联免疫法

在免疫分析法被大量应用于激素分析的情况下，放射免疫法的诸多缺点如示踪物储藏时间短、废物核辐射泄露、必须特殊的放射性装置等也渐渐受到分析人员的诟病，在此基础上引入了酶联免疫法等非放射性免疫分析法。Walter Hubl等于1988年用辣根过氧化物酶作为酶标记，开发了一个双抗体／聚乙烯乙二醇固相酶联免疫的方法，该方法使用涂有蛋白A和第二抗体的微量滴定管，大大节约成本，且方法有较好的重复性（相对标准偏差为5.0%～6.0%）和回收率（91%～97%）［13］。古巴免疫分析中心的 Ernesto Carlos Gonzále等人于2008年开发了一种快速、简单的酶联免疫方法，以17α-羟孕酮结合碱性磷酸酶与17α-羟孕酮结合血清竞争，采取兔抗体血清，分析滤纸上血点内17α-羟孕酮，分析缓冲液中以达纳错替代17α-羟孕酮甾体激素结合蛋白，整个分析时间为3 h，分析范围是10～250 nmol／L，日间和日内标准偏差与17α-羟孕酮浓度有关分别为5.5%～8.2%和6.4%～9.1%，分析回收率达到98%～103%，该方法能够很好地用于新生儿CAH检测［14］。

1.3 时间分辨荧光免疫法

芬兰临床分析中心Ruben Rene Gonzalez等在RIA方法的基础上开发了一种快速、高通量的直接固相时间分辨荧光免疫法（TRFLA）检测血清和干血滤纸斑点中的17α-羟孕酮，他们使用17α-OHP-3-carboxymethyloxime与聚赖氨酸（polylysine）结合作为标记，使得每个17α-羟孕酮分子能够结合34原子的铕，具有更高的放射性活度，这个分析基于标记的17α-OHP3CMO和17α-羟孕酮在血液样本中与多克隆兔17α-羟孕酮抗体的竞争，标记的抗体混合物通过与兔抗体表面结合进行分离，分析缓冲液包含达那唑来取代17α-羟孕酮与血清中蛋白的绑定。对于血清样品，常温下孵化完成需要1 h，而对于干血滤纸斑点需要在4℃放置过夜，同一分析物采取的两种样本测定结果有较好的一致性，该方法对血清和干血滤纸斑点中17α-羟孕酮最低检测限分别为0.10 nmol／L和0.75 nmol／L，日内和日间测定结果的相对标准偏差在 5%～15% 之间［15］。

1.4 液相色谱法

大多数免疫方法在进行血清中的激素分析前，首先要对样品进行层析分离或者用其它方法纯化，造成整个分析过程冗长、复杂，而且在前处理过程中容易造成待分析成分的丢失，由于交叉反应难以保证分析的特异性，使得分析结果不准确，分析不确定度增加。为了避免上述缺点，液相色谱被引用进行唾液或血清中的激素分析。康涅狄格大学的Ernesto Canalls等较早开发了血清中17α-羟孕酮的高效液相色谱分析方法，该实验用二氯甲烷从1 mL血清中萃取待测物，萃取液用0.1 mol／L的氢氧化钠溶液和水冲洗后在氮气上吹干，然后用甲醇-水混合液复溶，样品用μBondapak C18色谱柱分析，17α-羟孕酮检出限达到 2.5 μg／L，加标回收率达到95%～105%，分析结果的不确定度小于10%。该方法通过优化液相流动相，使得血清中氢化可的松、11-羟基可的松和17α-羟孕酮的保留时间不同，从而同时检测血清中多种激素含量，方法简单、准确且与RIA方法测定数据趋势一致［16］。

1.5 气相色谱-质谱法

随着质谱技术的发展，由于其较高的灵敏度而被大量引入进行血清中激素的分析研究，上海复旦大学的邓春辉、张祥民等人使用N，O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺作为衍生试剂，以乙腈为溶剂，在微波照射下使得血清中17α-羟孕酮发生三甲基硅烷化反应，微波功率700 W，实验发现微波照射可以增加羰基结合含氧基团，降低衍生反应时间，反应时间缩短为120 s，远小于传统的反应时间45 min。衍生物进气相色谱-质谱（GC-MS）检测，选用HP-5 MS柱（30 m×0.25 μm，0.25 mm），采用不分流模式，进样体积为1 μL，柱温程序：初始温度80℃，以15℃／min的速度升温到300℃，保持10 min，采用选择离子检测模式（SIM）在EI源下检测m／z359离子，四级杆、传输线和离子源温度分别为150，280，230℃。该方法定性检出限达到 1.0 ng／mL，方法重复性相对不确定度小于7.9%，方法回收率为102%［17］。

1.6 液相色谱-质谱法

文献记载了很多气相色谱-质谱联用方法测定血清中17α-羟孕酮等甾体激素，这些方法都有很好的特异性，但是往往反应通量很低，需要较大体积的血清原料，美国盐湖城大学Mark. M. Kushnir等开发了一种灵敏、特异的液相色谱串联质谱法（LC-MS／MS）同时分析4种血清中肾上腺甾体激素，该方法前处理使用样品量为200 μL，加入一定量的内标标准溶液，样品通过固相微萃取（SPE），最后用甲基叔丁基醚（MTBE）洗脱，洗脱液在氮气下吹干后，加入300 μL pH 10的羟胺水溶液复溶衍生，涡旋而且在90℃孵化30 min，衍生后溶液用2 mL MTBE萃取，萃取溶液吹干后用流动相复溶进行质谱检测。质谱条件：ESI源，多重离子检测模式（MRM），检测离子对为361.2／124.1，361.2／112.1，该方法定量检出限为0.05 μg／L，定性检出限为0.025 μg／L，回收率达到 97.2%［18］。

上述方法虽然采用了LC-MS-MS提高了灵敏度和特异性，但是实验中采用了衍生的步骤，而衍生实验对于实验人员的专业要求较高，不利于各个实验室的普及，在此基础上加拿大的Michele. L. Etter等开发了SPE萃取后直接进行LC-MS-MS测定的方法，氘代17α-OHP 作为内标加入血清样品中，混合均匀后进行SPE萃取，用C16反相氨基色谱柱分离，分析时间为7 min，定量用ESI源正离子模式选择离子监控模式，17α-羟孕酮和氘代17α-羟孕酮离子对分别为：331／109和339／113。该方法日内和日间不确定度分别为7.4%和10.0%，线性范围为0.156～80 nmol／L，定量检出限为 0.2 nmol／L［19］。

2 国内外血清中17α-OHP临床参考系统研究现状及展望

目前，涉及临床、大众健康、生物技术等领域的标准物质研制是各国研究的重点和热点［20］。欧盟（IRMM）仅肌酐有不同浓度的基体标准物质，如血清肌酐BCR573，BCR574以及BCR575；血清中雌二醇也有3种不同浓度的基体标准物质BCR576，BCR577及BCR578；血清氢化可的松标准物质ERM-DA192，ERM-DA193，ERM-DA451三种；血清中孕酮的标准物质BCR-348R，ERM-DA347等。美国NIST已经研制了多种血清基体标准物质和激素类纯品标准物质，例如胆固醇纯品标准物质SRM911，SRM911a；尿素纯品标准物质SRM912a；尿酸纯品标准物质SRM913a；肌酐纯品标准物质SRM914a；氢化可的松纯品标准物质SRM921；冰冻血清标准物质（肌酸）967a；冰冻血清标准物质（氢化可的松、睾酮、孕酮）SRM971等。作为其工作的一部分，开发了新的快速液相-同位素稀释质谱法（ID-LC／MS）来代替之前的气相-同位素稀释质谱法（ID-GC／MS）。

澳大利亚针对奥运食品中兴奋剂检测也研制了睾酮及其氘代物的纯度标准物质，分别为NARL CRM M914和NARL CRM D546，已应用于临床检验的量值溯源。日本临床化学方面标准物质主要有胆固醇纯品标准物质NMIJ CRM 6001-a、肌酐纯品标准物质NMIJ CRM 6005-a。

国际临床检验高准确度标准物质也有很多不完善之处，有很多检验项目，包括激素、传染病血清学检测标志物等缺乏相应的标准物质，只有一些标准方法而没有相应的标准物质配合使用，如17α-羟孕酮、雌酮以及雌三醇等均无有证标准物质以供临床检验使用。

目前，中国计量科学研究院化学所最新研制的标准物质有冰冻人血清尿素成分标准物质（GBW 09157）、冰冻肾病人血清尿酸成分分析标准物质（GBW 09169）、冰冻人血清肌酐成分分析标准物质（GBW 09170，GBW 09171），及冰冻人血清葡萄糖、肌酐、尿酸、尿酸标准物质（GBW 09174，GBW 09175，GBW 09176）。然而国内针对纯品标准物质17α-羟孕酮、血清中的重要非肽激素类物质如17α-羟孕酮的标准物质研究尚未见报道。中国计量科学研究院化学所应国家科技部门的要求，正在进行利用LC-IDMS方法针对纯品17α-羟孕酮和血清中17α-羟孕酮基准方法的研究，一些方法学检验数据表明，该方法准确可靠。目前正在对该方法进行完善，以提高灵敏度、增加检测通量、减少溶剂用量。

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Determination Method of 17α-OHP in Serum and Its Research Progress

Zhoujian1，2， Dai Xinhua2， Li Hongmei2， Gong Aijun1
(1. School of Chemical and Biological Engineering， University of Science and Technology Beijing， Beijing 100083， China；2. Chemical Metrology and Analytical Science Division， National Institute of Metrology， Beijing 100013， China)

The important of measure of 17α-OHP in the field of clinical diagnosis was illustrated.Determination methods for 17α-OHP and their research progress were systematically summarized.

erum 17α-OHP; immunization; HPLC; isotopic dilution MS

O652.2

A

1008–6145(2012)02–0096–03

10.3969／j.issn.1008–6145.2012.02.30

*国家科技基础专项(2011FY130100)

联系人： 周剑；E-mail： zhoujian_8382@yahoo.cn

2011-11-03