猪链球菌2型毒力因子研究进展

吴立志，王金良，肖跃强，李书光，祖立闯，伍晓雄，沈志强＊

（1．华中农业大学动物医学院，湖北武汉430070；2．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

猪链球菌2型毒力因子研究进展

吴立志1，2，王金良2，肖跃强2，李书光2，祖立闯2，伍晓雄1＊，沈志强2＊

（1．华中农业大学动物医学院，湖北武汉430070；2．山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州256600）

猪链球菌2型（SS2）是一种重要的人兽共患病病原菌，其主要毒力因子包括荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、溶血素、纤连蛋白结合蛋白、谷氨酸脱氢酶等，但是这些经典的毒力因子不足以解释猪链球菌病发病的临床症状，而且毒力表型往往与实际毒力及临床症状不符。近年来随着研究的深入，鉴定出一系列毒力相关元件，主要有Sao蛋白、存在于89K毒力岛的双信号转导系统（salk－sal R）、dlt A基因、pgd A基因、srt A基因、Ⅳ型二肽基肽酶（dipeptidyl peptidaseⅣ，DPPⅣ）、毒力调控子R（control of virulence R，Cov R）、烯醇酶（enolase）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，Gln A）等。论文对以上毒力因子研究进展进行综述，以期为SS2毒力因子及致病机制研究提供参考。

猪链球菌2型；毒力因子；致病机制

猪链球菌2型（Streptococcussuisserotype 2，SS2）是重要的人兽共患病病原。1998年和2005年分别在我国江苏省和四川省暴发了人感染猪链球菌2型的疫情，患者表现出中毒性休克综合症（STSS）、败血症、脑膜炎甚至死亡等严重的临床症状［1］。猪链球菌是猪的常在菌群，属于条件致病菌，虽然对多种抗生素敏感（尤其是四环素），但是抗生素在猪场长期性预防应用时易造成多种病菌耐药性的增强［2］，并且SS2多呈与其他病原混合感染或者继发感染，对我国养猪业造成重大损失。疫苗免疫是控制疫病的关键措施之一，为了研制高效的疫苗，近些年国内外对SS2进行了系统的病原学、流行病学、病理学、免疫学相关研究，尤其是毒力因子及致病机理的研究取得了一定的研究进展，表现在对经典毒力因子致病机理的进一步阐明和新的毒力相关元件的发现。本文就SS2致病性毒力因子的研究做一综述，以期对SS2疫苗的开发研究提供参考。

1 已知的毒力因子

1．1 荚膜多糖

荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）作为SS2的毒力因子最先由Smith H E等［3］报道，他们的研究鉴定了11个开放阅读框，其产物参与CPS的合成，采用插入诱变的方法获得两个无CPS的SS2突变株，进行猪感染试验发现突变株对肺泡巨噬细胞极其敏感，容易被吞噬，说明CPS在SS2抵抗免疫细胞吞噬过程发挥作用；而且无荚膜突变株接种SPF乳猪不能引起任何症状，说明CPS是重要的黏附因子。但是，不同SS2菌株的CPS成分会有差异，在制备过程中难获得稳定结构的CPS，而且多糖属于非胸腺依赖性抗原，其免疫原性差，作为疫苗效果并不理想。

1．2 溶菌酶释放蛋白和胞外因子

对溶菌酶释放蛋白（muramidase－released protein，MRP）和胞外因子（extracellular factor，EF）的研究说明SS2毒力具有菌株的差异。通过对致病菌株和无毒株MRP、EF表型进行统计学分析表明，MRP和EF与SS2致病性相关［4］；MRP可黏附上皮细胞，并可诱导上皮细胞凋亡，确证了 MRP是SS2的毒力因子；EF存在于某些菌株培养物上清中，其氨基酸序列呈现多态性。将基因工程蛋白MRP及EF免疫猪，可以获得抵抗SS2感染的保护力。MRP与A群链球菌的主要毒力因子M蛋白具有同源性，是亚单位疫苗的候选分子之一。

1．3 溶血素

溶血素（suilysin，Sly）在SS2指数增长后期产生，属于硫醇激活的穿孔毒素家族，作用于红细胞膜上胆固醇而溶解细胞。不同动物红细胞对溶血素的敏感性不同，人O型红细胞最敏感，马 、绵羊、牛、猪红细胞敏感性次之，兔子最不敏感。Jacobs A A等［5］从SS2培养上清中纯化出的Sly具有溶解红细胞活性，用其免疫小鼠后可使小鼠获得完全保护力。制备的Sly的抗体可以失活溶红细胞作用，但是在感染产Sly的SS2的猪血清中不能检测到Sly的抗体，预示着Sly在SS2感染猪的过程中破坏血液生理环境、阻抑免疫系统机能方面发挥重要作用，其具体机制有待进一步研究。

1．4 纤连蛋白结合蛋白

纤连蛋白结合蛋白（fibronectin binding protein，FBP）广泛存在于各血清型的猪链球菌中，纯化的FBP蛋白可以结合人纤连蛋白和纤维蛋白原，显示了其黏附作用［6］。制备的FBP缺陷突变株与野毒株在病猪器官的分布情况表明FBP不是SS2定殖扁桃体的必要因子，但在其他器官中突变体的定殖数量明显少于野毒株。因此，FBP是SS2的毒力因子，主要作用是提供黏附能力和干扰纤连蛋白正常功能。

1．5 谷氨酸脱氢酶

SS2中谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDh）以α－酮戊二酸为底物来参与菌体的能量代谢。GDh广泛存在于各血清型猪链球菌菌体表面，具有很好的免疫原性，可作为保护性抗原和诊断抗原；Kutz R等［7］通过活性染色分析发现SS2强毒株、弱毒株与无毒株GDh活性存在差异，不同毒株的GDh存在特定的氨基酸替换，并依此建立了区分SS2不同毒力毒株的PCR检测方法。

2 新鉴定的毒力因子

2．1 Sao蛋白

Li Y等［8］利用SS2基因表达文库和猪感染后的恢复血清抗体库研究发现了Sao蛋白，Western blot证明该蛋白存在于猪链球菌的绝大部分血清型中，并且利用免疫电镜技术证明该蛋白存在于SS2表面。用兔抗Sao蛋白 血清调理吞噬试验证明该抗体对SS2具有杀菌活性。虽然不同SS2菌株Sao蛋白具有多态性，但动物保护性试验证明Sao蛋白对不同SS2菌株均具有良好的保护力［9］。由此可见，Sao蛋白是优秀的蛋白亚单位疫苗候选分子，其在SS2感染过程中的作用及致病机理尚需进一步研究。

2．2 存在于89K毒力岛的双信号转导系统

1998年和2005年暴发的猪链球菌病的病人出现特异性的中毒性休克综合征，是导致人死亡的主要临床症状［10］。从这些病人体内分离的SS2中发现89K毒力岛，分子生物信息学分析发现该区域存在与唾液链球菌同源的双信号转导系统（salk－salR）双信号转导调节系统元件。Li M等［11］敲除这一元件构建了SS2突变株，仔猪感染试验证明Sal K／SalR的存在是SS2完全毒力的必要结构；定殖试验表明突变株SS2不能单独定殖于任何猪的组织；杀菌试验发现突变株抵抗多形核白细胞的杀伤力显著降低；表达芯片分析发现突变株下调了26种基因的表达水平。以上研究充分说明89K毒力岛与SS2的致病性密切相关，但其具体机制仍待进一步研究。

2．3 dlt A基因

脂磷壁酸（LTAs）是锚定于革兰阳性细胞膜的阴离子聚合物，被认为是该类细菌的黏附因子。LTAs通常有不同程度的D－丙氨酰化，受基因dlt A控制。Fittipaldi N 等［12］构建了dlt A 缺失突变SS2，发现突变株对阳离子抗菌肽敏感性增加；与野毒株相比突变株SS2抵抗中性粒细胞的杀伤能力、黏附和入侵脑微血管内皮细胞的能力均降低，对CD1小鼠和猪的感染能力下降，这可能是由于LTAs不能D－丙氨酰化，使得菌体细胞膜负电荷增加引起排斥性静电力导致细胞膜的不稳定性，最终降低了SS2感染能力。脂磷壁酸的D－丙氨酰化影响SS2毒力的确切机制有待进一步证实。

2．4 pgd A基因

Fittipaldi N等［12］鉴定出SS2肽聚糖N端脱乙酰作用相关基因pgd A，并制备了该基因的缺失突变株SS2。体外试验表明，pgd A基因的缺失导致SS2对溶菌酶的敏感性增加，动物感染试验发现突变株毒力减弱，野毒株SS2体外与中性粒细胞共培养和感染小鼠过程中pgd A表达水平均上调，提示肽聚糖N端脱乙酰作用可能是SS2抵抗机体免疫系统的重要机制。

2．5 srt A基因

革兰阳性细菌中，一些表面蛋白C－末端的LPXTG基序是这些蛋白定位于细胞表面的信号肽序列。Sortase A作为转肽酶来催化肽聚糖交联桥的甘氨酸氨基团与LPXTG基序的苏氨酸羧基团形成酰胺键以达到锚定的作用。Wang C等［13］扩增了SS2的srt A基因，srt A编码的蛋白与金黄色葡萄球菌的Sortase A蛋白同源，并且发现缺失srt A基因的SS2突变株毒力减弱，丧失与人细胞黏附作用。而SS2的溶菌酶释放蛋白（MRP）和Sao蛋白是已经证明了的SS2毒力因子和黏附因子，并且含有LPXTG基序，间接说明srt A编码的蛋白促进了细菌表面蛋白与胞壁的结合。

2．6 Ⅳ型二肽基肽酶

Ⅳ型二肽基肽酶（dipeptidyl peptidaseⅣ，DPPⅣ）最初被认为是一种T细胞活化抗原CD26，也是一种腺苷脱氨酶（ADA）结合蛋白。在哺乳动物组织中广泛表达。可以迅速且特异性地裂解肽链N末端第二位的脯氨酸或丙氨酸残基，其配体多种多样，参与机体的能量代谢、物质代谢、免疫系统活动。Ge J等［14］首次报道了SS2 DPPⅣ同源物，测定其具有酶活性，并且可以结合人纤连蛋白，构建的DPPⅣ缺失株SS2对动物感染能力下降。但DPPⅣ发挥作用的具体机制仍待进一步研究。

2．7 毒力调控子

二元信号转导系统（two component signal transduction systerm，TCSTS）作为致病菌中遍存在的一种信号转导机制，在调节毒力基因表达和构成细菌致病性等方面发挥着重要作用。毒力调控子R（control of virulence R，CovR）是A群、B群、C群以及变形链球菌中普遍存在的重要的反应调节因子，调控众多细菌毒力相关基因的转录表达［15－16］。Pan X等［17］在SS2中发现独立存在的Cov R，并建立了CovR缺失株，试验证明缺失株与上皮细胞的黏附能力、抵抗中性粒细胞和单核细胞的吞噬与杀伤能力、对组织的定殖能力大大加强；转录谱分析发现Cov R的存在不同程度抑制了195个基因的转录，其中包括一些已经证明的毒力因子。因此，Cov R被认为是SS2毒力因子的全局调控子。

2．8 烯醇酶

烯醇酶（enolase）能够催化2－磷酸－甘油酸失水而生成磷酸烯醇丙酮酸，参与糖酵解过程。Esgleas M等［18］证明具有酶活性的烯醇酶存在于SS2，并且其可结合于人纤连蛋白；免疫电镜观察到烯醇酶存在于SS2表面，是SS2的黏附因子。Zhang A等［19］原核表达了SS2烯醇酶重组蛋白，该重组蛋白对小鼠具有免疫保护力；实时定量PCR监测发现烯醇酶为体内诱导表达抗原。因此，烯醇酶为SS2毒力因子，可能为保护性抗原，具有蛋白亚单位疫苗开发价值。

2．9 次黄嘌呤单磷酸脱氢酶

Zhang X H等［20］鉴定出了SS2合成次黄嘌呤单磷酸脱氢酶（IMPDH）的基因impdh，并将其原核表达纯化出具有酶活性的IMPDH。构建的impdh缺失突变株生长极其缓慢，对小鼠和猪进行多次攻毒未能致死。IMPDH是嘌呤合成途径限速酶，影响菌体的增殖。由此可见，IMPDH为SS2完全毒力所需，可能是因为其影响整个菌体的核酸代谢，其中包括毒力相关因子的编码基因和细菌增殖所必需的基因组复制。这对于发现SS2关键毒力因子也许没有太大意义，但为我们提供了防治猪链球菌病另外的思路——抑制菌体的基础代谢率可以消除菌体对动物机体的高致病力。

2．10 谷氨酰胺合成酶

谷氨酸与游离分子氨在谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，Gln A）的作用下生成谷氨酰胺，这个反应是可逆的。对于氨基酸的分解代谢与合成代谢有非常积极的意义。Si Y等［21］缺失掉合成SS2 Gln A的基因gln A制备了突变株，细胞黏附试验表明突变株对上皮细胞的黏附能力大大降低；小鼠攻毒试验说明gln A缺失突变株为弱毒株。Gln A影响的是菌体氨基酸代谢，突变株毒力减弱可能是因为蛋白质类毒力因子的产生受到影响，而其毒力没有完全丧失提示SS2毒力可能还有非蛋白质类因子的参与。

3 结语

综上所述，对SS2毒力因子的研究已经有了很多，并且对这些毒力因子的作用机制也有了初步认识，但仍然不能形成区分SS2强毒株与弱毒株的标准。需要特别说明的是，目前非常流行基因缺失或突变法研究基因对SS2毒力的贡献或影响［22－24］，这种方法鉴定出的基因元件可能并非SS2毒力因子，因为很多基因参与SS2的基础代谢，缺失之后会影响SS2的生长，以至于造成毒力降低或者消失的假象。但是这种方法却提供了控制猪链球菌病另外的途径——通过突变或缺失基因获得可用作疫苗的弱毒株。

目前越来越多的学者认为SS2的毒力是多种毒力因子协同作用的结果，因为SS2感染人或者猪后导致了几种典型的临床症状，如脑膜炎、中毒性休克等。现在尚缺乏可靠的针对SS2引起各种特异症状的动物模型，以至于始终不能确定引起各特征症状的超级抗原，也无从真正了解其发病机制。猪链球菌的其他方面研究也尚未明朗，如猪链球菌是猪体常在菌群，定殖于猪扁桃体，是什么引起猪链球菌病的暴发？从非致病到致病状态转化的原因，可能是SS2非毒力株或弱毒株向强毒株的转化，也可能是猪体状态的变化（如免疫力下降），还可能是双方协同变化的结果？目前的研究主要关注SS2毒力因子及其致病机理，寄希望于建立区分不同毒力株的标准，尚不能彻底解决猪链球菌病的威胁。因此，今后SS2致病因子的研究可能会更加关注与猪体的相互作用，尤其是猪体自身的变化，相信在不久的将来关于猪链球菌暴发因素的研究会有更进一步进展。

［1］ Gottschalk M，Xu J，Calzas C，et al．Streptococcussuis：a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen［J］．Future Microbiol，2010，5（3）：371－391．

［2］ Hoa N T，Chieu T T，Nghia H D，et al．The antimicrobial resistance patterns and associated determinants inStreptococcus suisisolated from humans in southern Vietnam，1997－2008［J］．BMC Infect Dis，2011，6（3）：471－491．

［3］ Smith H E，Damman M，Van Der Velde J，et al．Identification and characterization of the cps locus ofStreptococcussuisserotype 2：the capsule protects against phagocytosis and is an important virulence factor［J］．Infect Immun，1999，67（4）：1750－1756．

［4］ Vecht U，Wisselink H J，Jellema M L，et al．Identification of two proteins associated with virulence ofStreptococcussuistype 2［J］．Infect Immun，1991，59（9）：3156－3162．

［5］ Jacobs A A，Van Den Berg A J，Loeffen P L．Protection of experimentally infected pigs by suilysin，the thiol－activated haemolysin ofStreptococcussuis［J］．Vet Rec，1996，139（10）：225－228．

［6］ De Greeff A，Buys H，Verhaar R，et al．Contribution of fibronectin－binding protein to pathogenesis ofStreptococcussuisserotype 2［J］．Infect Immun，2002，70（3）：1319－1325．

［7］ Kutz R，Okwumabua O．Differentiation of highly virulent strains ofStreptococcussuisserotype 2 according to glutamate dehydrogenase electrophoretic and sequence type［J］．J Clin Microbiol，2008，46（10）：3201－3207．

［8］ Li Y，Gottschalk M，Esgleas M，et al．Immunization with recombinant Sao protein confers protection againstStreptococcus suisinfection［J］．Clin Vaccine Immunol，2007，14（8）：937－943．

［9］ Feng Y，Zhang H，Ma Y，et al．Uncovering newly emerging variants ofStreptococcussuis，an important zoonotic agent［J］．Trends Microbiol，2010，18（3）：124－131．

［10］ Baums C G，Valentin－Weigand P．Surface－associated and secreted factors ofStreptococcussuisin epidemiology，pathogenesis and vaccine development［J］．Anim Health Res Rev，2009，10（1）：65－83．

［11］ Li M，Wang C，Feng Y，et al．Sal K／SalR，a two－component signal transduction system，is essential for full virulence of highly invasiveStreptococcussuisserotype 2［J］．PLoS One，2008，3（5）：e2080．

［12］ Fittipaldi N，Sekizaki T，Takamatsu D，et al．D－alanylation of lipoteichoic acid contributes to the virulence ofStreptococcussuis［J］．Infect Immun，2008，76（8）：3587－3594．

［13］ Wang C，Li M，Feng Y，et al．The involvement of sortase A in high virulence of STSS－causingStreptococcussuisserotype 2［J］．Arch Microbiol，2009，191（1）：23－33．

［14］ Ge J，Feng Y，Ji H，et al．Inactivation of dipeptidyl peptidase IV attenuates the virulence ofStreptococcussuisserotype 2 that causes streptococcal toxic shock syndrome［J］．Curr Microbiol，2009，59（3）：248－255．

［15］ Negrini T，Duque C，Vizoto N，et al．Influence of Vic RK and Cov R on the interactions ofStreptococcusmutanswith phagocytes［J］．Oral Dis，2011，5（3）：371－391．

［16］ Chong P，Drake L，Biswas I．Modulation of covR expression inStreptococcusmutansUA159［J］．J Bacteriol，2008，190（13）：4478－4488．

［17］ Pan X，Ge J，Li M，et al．The orphan response regulator Cov R：a globally negative modulator of virulence inStreptococcus suisserotype 2［J］．J Bacteriol，2009，191（8）：2601－2612．

［18］ Esgleas M，Li Y，Hancock M A，et al．Isolation and characterization of alpha－enolase，a novel fibronectin－binding protein fromStreptococcussuis［J］．Microbiology，2008，154（9）：2668－2679．

［19］ Zhang A，Chen B，Mu X，et al．Identification and characterization of a novel protective antigen，enolase ofStreptococcus suisserotype 2［J］．Vaccine，2009，27（9）：1348－1353．

［20］ Zhang X H，He K W，Duan Z T，et al．Identification and characterization of inosine 5－monophosphate dehydrogenase inStreptococcussuistype 2［J］．Microb Pathog，2009，47（5）：267－273．

［21］ Si Y，Yuan F，Chang H，et al．Contribution of glutamine synthetase to the virulence ofStreptococcussuisserotype 2［J］．Vet Microbiol，2009，139（1－2）：80－88．

［22］ Feng Y，Zhang H，Ma Y，et al．Uncovering newly emerging variants ofStreptococcussuis，an important zoonotic agent［J］．Trends Microbiol，2010，18（3）：124－131．

［23］ Wang Y，Zhang W，Wu Z，et al．Functional analysis of luxS inStreptococcussuisreveals a key role in biofilm formation and virulence［J］．Vet Microbiol，2011，152（1－2）：151－160．

［24］ Zhu H，Huang D，Zhang W，et al．The novel virulence－related gene stp ofStreptococcussuisserotype 9 strain contributes to a significant reduction in mouse mortality［J］．Microb Pathog，2011，51（6）：442－453．

Advance in Virulence Factors ofStreptococcus suisSerotype 2

WU Li－zhi1，2，WANG Jin－liang2，XIAO Yue－qiang2，LI Shu－guang2，ZU Li－chuang2，WU Xiao－xiong1，SHEN Zhi－qiang2

（1．CollegeofVeterinaryMedicineinHuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan，Hubei，430070，China；2．ShandongBinzhouAnimalScienceAndVeterinaryMedicineInstitute，Binzhou，Shandong，256600，China）

Streptococcussuistype 2（SS2）is an important pathogenic bacterium which can cause amphixenosis，whose primary virulence factors include capsular polysaccharide（CPS），muramidase－released protein（MRP），suilysin（Sly），fibronectin binding protein（FBP），glutamate dehydrogenase（GDH）et．，but the clinical symptoms caused by SS2 did not correspond with the virulence phenotype．With the development of research，some new virulence components have been identified，include the follows：protein Sao，the twocomponent signal transduction system（salk－sal R）exist in the 89k pathogenicity island，the dlt A gene，the srt A gene，dipeptidyl peptidase IV（DPP IV），control of virulence R（Cov R），enolase，glutamine synthetase（Gln A）et．This article focused these virulence factors and their nosogenesis in SS2 infection．

Streptococcussuisserotype 2；virulence factor；pathogenesis

S852．4

A

1007－5038（2012）06－0118－05

2012－02－25

吴立志（1986－ ），男，安徽池州人，硕士，主要从事动物生理生化与分子免疫学研究。＊通讯作者

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