脑心肌炎病毒及其蛋白结构和功能研究进展＊

凡静静，冯若飞，马忠仁＊

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃 兰州 730030）

脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）是一种重要的人畜共患病病原，属于微RNA 病毒科心病毒属（Cardiovirus）[1]。病毒粒子呈圆形，无囊膜，核衣壳呈二十面体对称，直径约为27nm～30nm，分子质量约2600ku，在氯化铯中的浮密度为1.33g／cm3～1.34g／cm3。具有血凝性，可凝集绵羊红细胞，可以抵抗乙醚、氯仿、乙醇等脂溶性溶剂，电离辐射、酚和甲醛可使此病毒失去活性，但病毒对热有一定抵抗力，60℃加热1h可被灭活，置－70℃可长期保存，对胰蛋白酶敏感性有所不同，二价阳离子对病毒没有明显的保护作用[2]。

1945年，Helwig FC等[3]从佛罗里达州一只患急性致死性心肌炎的黑猩猩体内首次分离得到该病毒，1958年在巴拿马首次证实EMCV是猪的一种致死性疾病的病原[4]。EMCV能够引起猪产生急性病毒性传染病，对非人灵长类动物的心肌、中枢神经系统、脾脏等产生急性或持续性感染，并且具有体外感染人心肌细胞的能力[5]。猪感染后，机体对外排毒及病毒血症的时间极短，仅在感染后1d～3d可以从血清、鼻拭子、肛拭子中分离到病毒[6]。机体内病毒存留的时间也很短，仅可在感染后1d～5d死亡仔猪的心、扁桃体、肝、肾和肺等组织器官中分离到病毒[7]，给病毒的分离带来一定的困难。由于其宿主广泛，不仅可以给养猪业造成经济损失，而且能够跨种间传播，对人构成潜在危害。有研究不仅在人类血清中检测到了EMCV抗体，而且还从热性病患者体内分离到了病毒[8]。因此，EMCV是重要的人兽共患病致病因子。论文对该病毒基因结构和功能的研究进行了综述。

1 脑心肌炎病毒基因组结构及编码蛋白特征

EMCV为单股正链RNA病毒，全长约7.8kb，包括5′UTR、3′U TR和中间一个较大的开放读码框 （ORF），5′端包含709nt，3′端包含137nt，ORF长为6879nt，编码由2292个氨基酸组成的多聚蛋白。该多聚蛋白在3种蛋白酶的作用下被逐步分解，首先分解成前体蛋白P1、P2、P3和一个病毒自身编码的引导蛋白或L蛋白，最终切割成11个蛋白终产物：P1区的VP1～VP4、P3区的3A～3D和P2区的2A～2C、病毒自身编码的前导蛋白（L蛋白）[9]。

P1区核苷酸序列由1A、1B、1C和1D4个基因编码序列组成，分别编码结构蛋白VP4、VP2、VP3和 VP 1，分子质量依次为8、28、25、30ku。这4种结构蛋白组成了病毒的衣壳粒子，每60个衣壳粒子组成病毒的衣壳，是病毒抗原位点的所在，且以VP1的免疫原性最强。

P2及P3区核苷酸序列主要编码非结构蛋白，包括2A、2B、2C、2D、3A、3B及蛋白酶3C和 RNA依赖性聚合酶3D，与病毒基因组的复制关系密切[10]。研究表明，非结构蛋白编码区比结构蛋白编码区保守，而且1987年之后分离的猪源EMCV非结构蛋白中3D最为保守、2A变异最大，结构蛋白中VP2最为保守、VP1变异最大[1]。

EMCV转录机制独特，其5′末端没有 “帽子”结构，由20个氨基酸组成的 VPg充当病毒的“帽子”，5′UTR区域较大，包括1个特殊结构——内部核糖体进入位点 （internal ribosomal entry site，IRES）。IRES由大约450个碱基组成，其作用是引导病毒基因组不经过正常的5′“帽子”末端结构而直接进行多聚蛋白的翻译[11]。在近5′端有Poly（C），长度约50nt～150nt。3′UTR是复制酶的第一结合位点，其二级结构在病毒的翻译与复制过程中具有重要作用，该区是病毒复制酶识别并结合的位点，主要起始负链RNA的合成。3′UTR在病毒的翻译过程及感染性病毒粒子的形成过程中起着十分重要的作用[12]。

2 EMCV结构蛋白与非结构蛋白的功能

结构蛋白拥有抗原表位，常用于基因工程疫苗研究，非结构蛋白与病毒的复制、核定位及感染等有关。EMCV的4种结构蛋白均参与病毒抗原表位的形成，VP1是最重要的中和性抗原表位。受选择性压力的影响，VP1需要不断发生变异以维持EMCV的存活。EMCV的主要抗原表位均位于VP1和VP3蛋白，同时已发现，VP3／VP1结合区是EMCV变异相对较大的区域[13]。

VP1还与病毒粒子表面的拓扑结构、抗原性、受体吸附及脱壳有关[14]。VP1蛋白刺激小鼠产生的多克隆抗体具有中和活性，可以中和EMCV在小鼠体内的感染能力，表明VP1蛋白是EMCV重要的保护性抗原。VP1基因核苷酸突变导致所编码氨基酸的变异可造成病毒血凝活性的丧失、病毒受体结合位点的改变，从而导致EMCV在致糖尿病型和非糖尿病型之间的转变[15]，表明VP1基因对EMCV的致病性发挥重要作用。EMCV衣壳蛋白VP1第100位氨基酸能够通过影响病毒在感染小鼠脑中的复制，特别是在神经细胞中的复制，从而影响EMCV对小鼠的致病性[16]。

VP2上存在的2个B细胞线性表位，有一定的免疫活性。VP3与病毒的细胞嗜性高度相关，也散存着一些抗原表位。VP4基因处于病毒结构蛋白的最内侧，抗原性最弱。

病毒非结构蛋白主要是编码蛋白加工相关蛋白和病毒基因组复制相关蛋白。EMCV的2A蛋白含有150个氨基酸，参与自动催化和病毒多聚蛋白的早期裂解。病毒多聚蛋白合成后，首先由2A蛋白酶将蛋白水解成P1和P2＋P3，再由3C蛋白酶将P1、P2和P3分别水解成单体1A、1B、1C、1D，2A、2B、2C和3A 、3B、3C、3D。EMCV感染时2A蛋白能抑制宿主细胞mRNAs帽子结构依赖性翻译的能力。这一抑制机制与2A病毒蛋白和游离的40S紧密结合但却不出现在80S聚集区有关。同时病毒的2A蛋白含有许多酵母核糖体蛋白都有的核定位信号，2A蛋白的缺失还阻止了病毒的核定位。Donnelly G D等[17]经研究报道，2A蛋白酶通过裂解翻译起始因子的eIF4G亚基，从而改变能与帽子结构结合的4E－EP1翻译抑制体的活性来抑制宿主细胞内的蛋白合成，抑制宿主细胞的翻译，这在病毒的起始加工过程中具有重要的作用，还对病毒RNA的复制起作用。L蛋白和2A蛋白协同作用，是病毒基因组产生抵抗宿主的防御特性[18]。

2B蛋白可以改变细胞膜，增加细胞膜的渗透性，这可能对病毒感染晚期病毒粒子的释放具有重要的作用。

2C基因参与病毒基因组的复制，其表达产物2C蛋白具有良好的免疫原性。2C和前体蛋白2BC对细胞内膜的重排、病毒诱导的细胞质囊泡的形成是必需的[19]。2C蛋白具有ATP酶活性，虽含有螺旋酶基序，但是不具有螺旋酶的活性。麦芽糖结合蛋白－2C融合蛋白具有ATP酶和GTP酶活性并能与 RNA 结合[20－21]。

3A（分子质量为10ku）是一个核心蛋白，对小RNA病毒逃避宿主的免疫反应具有重要的作用，且这种作用与病毒毒力和宿主范围有关。

3B蛋白（即VPg蛋白）是共价结合于正链和负链RNA 5′末端的蛋白引物。前体蛋白3AB可促进病毒RNA聚合酶3D的活性和促进3CD的自身切割。

3C和3CD病毒蛋白酶具有多重功能，与病毒RNA的结合、蛋白加工处理和RNA的复制过程相关。3C蛋白是在病毒加工处理过程和RNA复制中产生的重要蛋白，它具有一个半胱氨酸作为亲核作用的活性位点，其结构与糜蛋白酶样色氨酸蛋白酶结构相似[22]。3C和它的前体3CD在病毒蛋白的水解过程中发挥着主要作用。在被2A蛋白羧基末端附近的多肽段催化后，3C蛋白几乎参与了病毒蛋白的所有后期水解过程。经初级切割后，病毒蛋白3C（和3CD前体蛋白）对病毒蛋白前体进行二级切割。首先3C蛋白自身从P3前体蛋白切割下来，然后在P2－P3前体蛋白间进行重要的加工处理，切割产生病毒复制蛋白。

3D基因是EMCV的重要基因，编码RNA聚合酶，可以催化引物介导的反应中新生RNA链的延长，在病毒聚合酶复合物中发挥重要的作用。而且3D基因高度保守。1990年之后分离到的猪源EMCV其核苷酸同源性达到99%以上，因此可以根据3D基因序列设计RT－PCR引物用于检测EMCV[23]，作为免疫和感染动物的鉴别诊断抗原。

L蛋白由70个氨基酸组成的引导蛋白，其内部的“鋅指”基序能够稳定空间构象调控病毒mRNA转录、翻译[28]。Mengo病毒的L蛋白可以抑制由于病毒感染而引起的应激颗粒的堆积，表明L蛋白对应激颗粒有颉顽作用[24]。

3 5′UTR的功能及特性

EMCV内部核蛋白体进入位点（internal ribosomal entry site，IRES）是位于其基因组5′端非翻译区的顺式作用序列，能够在一些反式作用因子的辅助下，招募核糖体小亚基到mRNA的翻译起始位点，而不通过扫描机制寻找合适的翻译起始密码子，即介导核蛋白体不依赖mRNA 5′端7甲基鸟嘌呤核苷酸（m7G）帽的蛋白质合成起始机制[25]。

复杂稳定的二级结构是维持IRES元件活性的关键因素。有研究表明修饰EMCV的GNRA（G代表鸟嘌呤、N代表任意核苷酸、R代表嘌呤、A代表腺嘌呤）基序都能使其翻译活性大大降低，同时稳定的茎环结构也是IRES元件活性所必需的。宿主翻译相关因子与茎环结构的结合促使IRES构象发生改变，使其与核糖体复合物能够结合，从而使得翻译起始并得以顺利进行。

IRES序列的扩增要求完整、准确，才能有效启动EMCV的转录，从而产生具有感染性的RNA，EMCV的IRES末端序列对其IRES的活性影响极大[26]。IRES表达模式可较好地用来研究双基因或多基因的表达以及某些病毒基因与宿主细胞相互作用机制[26]，已经进入实践应用的如Clontech公司开发的pIRES2质粒[27]，它可以表达增强型绿色荧光蛋白 （EGFP），应用较为广泛。

4 3′UTR的功能及特性

小RNA基因组的末端具有非编码区（UTR），是病毒基因组复制的主要调控位点。3′非编码区（3′UTR）是复制酶的第一结合位点，其二级结构在病毒的翻译与复制过程中具有重要作用，该区是病毒复制酶识别并结合的位点，主要起始负链RNA的合成。3′UT R在病毒的翻译过程及感染性病毒粒子的形成过程中起着十分重要的作用[12]。

3′UTR可能与病毒抗原演化和病毒感染动物的嗜性有关，而内部的基序则成为起始复合物形成或维持空间构象的某些蛋白因子的结合平台[12]。3′UTR有PolyA的尾巴，它与病毒的RNA依赖性RNA聚合酶的结合过程有关。

5 展望

血清学研究发现，我国普遍存在EMCV的感染，针对病毒致病机制、基因特征和预防技术的研究逐渐成为该病毒的研究的热点。目前，其结构蛋白VP1、VP2等和非结构蛋白2C、3AB被选作为主要研究对象。对病毒基因组结构与功能的研究能加深对该病毒的了解，有望更加深入地研究病毒特征并能筛选有效的目标基因，研究建立疾病早期诊断的检测方法，获得有效的预防以及治疗性疫苗，探索阻断病毒传播的有效途径。

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