禽致病性大肠埃希菌黏附素研究进展

魏宽翠，夏玉龙，马兴树

（河北工程大学农学院分子生物学实验室，河北 邯郸 056021）

禽致病性大肠埃希菌（Avian pathogenic Escherichia coli，APEC）又名禽致病性大肠杆菌，主要引起禽大肠杆菌病，以下呼吸道感染、气囊炎、心包炎、肝周炎、脑膜炎和败血症为主要临床特征[1]。自然条件下多与其他细菌、病毒混合感染，呈世界性流行，给养禽业造成了巨大的经济损失，是危害养禽业的主要传染病之一[2－3]。有资料表明，鸡大肠杆菌病居鸡细菌性疾病之首，占33%。我国每年因大肠杆菌病死亡鸡3170万多只，经济损失3亿多元。禽致病性大肠埃希菌广泛的致病性显示了其基因组和毒力相关因子的多样性，其毒力因子包括黏附素（adhesins）、毒素（toxins）、铁获得因子（iron acquisition factors）、脂多糖（lipopolysaccharides）、多聚糖荚膜（polysaccharide capsules）和侵袭素（invasins）等[4]。到目前为止，国内外研究人员普遍认为黏附素的黏附作用在细菌的致病机制中发挥着重要作用，是细菌在宿主上皮细胞定植的第一步[5]。禽源大肠埃希菌黏附素与人畜源大肠埃希菌黏附素既有相似之处，又有明显差异，因此开展禽致病性大肠埃希菌菌毛黏附素特性研究，对揭示禽大肠杆菌病的发病机理及对该病进行免疫预防具有非常重要的意义。

1 黏附素

1.1 黏附素的成分及其作用

黏附素是具有黏附作用的各种细菌表面结构的统称，是细菌直接参与黏附的物质。黏附是病原菌接触和感染细胞的第一步，与致病性密切相关，它具有抵抗黏液冲刷、细胞纤毛运动清除等作用，有利于病原菌在宿主细胞的定植。禽致病性大肠埃希菌黏附素通常是细菌表面某种特定的糖脂成分或蛋白质结构，可以是多糖或单糖、糖脂、糖蛋白、多肽、蛋白质等，是一种具有多种结构和功能的多样化分子，可存在于细菌的细胞壁、外膜蛋白、鞭毛、菌毛及微毛（一种毛发样突出物）等结构中。黏附素的种类因菌种或菌株的不同而不同，或因同种不同菌株而不同，通常一种细菌只含1种黏附素，但有些细菌种或同种的个别菌株能同时表达2种或更多种黏附素[6]。Tatiana ADC等[7]的研究表明，不同临床症状的大肠杆菌病伴随不同黏附素基因的表达，即使一种症状也时常有几种菌毛黏附素基因同时表达。例如败血症和肿头综合征在多数情况下就有2种～3种甚至4种黏附素DNA序列的表达。

1.2 黏附素黏附黏膜上皮细胞的过程

黏附素黏附黏膜上皮细胞的过程比较复杂，在不同细菌间差别较大，但一般可将整个过程分为 两个阶段。黏附的第一阶段为聚集和吸附阶段，是细菌在黏膜上皮细胞表面聚集，吸附并发生非特异性结合的过程，细菌靠静电力、疏水力、分子运动等作用与上皮细胞表面接近。细菌与黏膜上皮细胞结合的过程在该阶段是可逆的，可能会因为在液体中震荡或冲洗而脱离，对去污剂也很敏感[8]。细菌黏附黏膜上皮细胞后可随机进入黏附的第 二阶段。黏附的第二阶段为特异性黏附阶段，是黏附素与上皮细胞受体发生特异性结合的过程，大肠埃希菌的菌毛顶部和周围布满了与受体结合的位点。黏附素松散地与受体结合后，信号转导肽引发宿主细胞的蛋白发生磷酸化。同时，细胞间Ca2＋浓度升高，并发生肌醇三磷酸化，使黏附素与受体以一种高度特异性的方式相互结合，该阶段一般不会因在液体中震荡或冲洗而脱离，对去污剂不敏感[8－9]。

2 黏附素的种类

目前，黏附素的分类依据还不统一，根据不同的标准，黏附素可以分成不同的种类。根据化学组成成分不同，黏附素可分为蛋白类黏附素和碳水化合物类黏附素；根据黏附素的形态结构差异，可将其分为菌毛黏附素（fimbriae或pilus）和非菌毛黏附素（afimbrial adhesin）；根据甘露糖血凝特性，可分为甘露糖抵抗血凝反应（MRHA）黏附素和甘露糖敏感血凝反应（MSHA）黏附素。人们往往根据其组成、形态、数目、分布、特性等的不同对其发现的新型黏附素进行命名。

通过对已知黏附素进行的研究，Tatiana ADC等[7]报道，APEC菌株中主要的黏附素分别是Ⅰ型菌毛、P菌毛、curli菌毛和温度敏感型血细胞凝集素。以下是对Ⅰ型菌毛、P菌毛、curli菌毛和温度敏感型血细胞凝集素的分述。

2.1 Ⅰ型菌毛黏附素

Ⅰ型菌毛结构是在电子显微镜下观察到的第一个细胞外非鞭毛丝状附着物。大肠埃希菌Ⅰ型菌毛有凝集各种动物红细胞，黏附多种组织表皮细胞，促进菌膜运动的能力，促使致病性大肠埃希菌与宿主上皮细胞受体的结合，但Ⅰ型菌毛的黏附作用受甘露糖抑制，即Ⅰ型菌毛为甘露糖敏感型菌毛[10]。

Naveh M W等[11]第一次报道Ⅰ型菌毛在禽致病性大肠埃希菌中的作用以及其对APEC感染的影响。该研究指出，在APEC感染中Ⅰ型菌毛黏附作用及其效果受发病鸡的数量和疾病程度的影响。大肠埃希菌Ⅰ型菌毛主要在禽气管、肺和气囊中的上皮细胞表达，在其他组织或血液中则几乎没有表达。运用MSHA法进行检测，Ⅰ型菌毛的检出率为60%以上，PCR法的检出率为80%以上。Tatiana ADC等[7]运用此两种方法进行试验发现Ⅰ型菌毛基因的检出率不高，与他人的研究结果相反，因此其推测大肠埃希菌Ⅰ型菌毛的分布具有一定的地域性。

近些年来，随着对Ⅰ型菌毛黏附素深入细致的研究，尤其是分子生物学等技术的运用，人们对Ⅰ型菌毛黏附素的认识正逐步加深。Ⅰ型菌毛黏附素是菌毛亚单位蛋白聚合物，至少含有163个氨基酸，因其缺乏色氨酸和蛋氨酸，故具有疏水性。Ⅰ型菌毛的编码基因位于染色体上，其合成涉及到fimA、fimB、fimC、fimD、fimE、fimF、fimG、fim I、和fimH共9个特定基因序列[12]，其中FimA菌毛蛋白是Ⅰ型菌毛的主要结构蛋白。大肠埃希菌Ⅰ型菌毛的表达是阶段性的，调节基因fimB和fimE控制Ⅰ型菌毛周期性的在有菌毛和无菌毛两种形态之间进行转变。FimD是菌毛在菌体上定位所必需的蛋白亚基，fimC则与FimA的生物合成有关。fimE，fimF，fimH与菌毛的黏附特性有关，且可能是Ⅰ型菌毛黏附素数量和长度的调控因子。fimH基因负责Ⅰ型菌毛甘露糖特性的表达和特殊黏附素受体的识别，而fimC是分子伴侣，直接负责Ⅰ型菌毛的组装。分子进化动力学的研究表明，通过对Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因序列的强度选择将会提高其与单一甘露糖和阴道上皮细胞的结合能力[13]。脑膜炎大肠埃希菌致病蛋白IbeA（invasion of brain endothelium A）具有调节fimH基因表达的作用，能够使细菌穿过血脑屏障导致脑膜炎[14－15]。

在Ⅰ型菌毛纯化试验中发现这些受体结合蛋白在不同血清型之间具有一定的抗原保守性。此外，还有实验证明各血清型菌株的Ⅰ型菌毛间存在一定的相同抗原位点且具有很高的同源性[16]。鉴于Ⅰ型菌毛基因结构和碳水化合物构型研究已基本清楚，用于抑制Ⅰ型菌毛与细菌黏附的低分子糖蛋白已经合成，有望用于候选疫苗，预防大肠杆菌病[17]。

2.2 P菌毛黏附素

近年来，P菌毛在APEC中的重要性引起了广泛的关注，在电镜下观察，P菌毛是由螺旋排列的亚单位蛋白组成的头发样附着物，类似于Ⅰ型菌毛，从而无法在形态学上区分P菌毛和Ⅰ型菌毛，但他们被识别和结合的受体不同。Ⅰ型菌毛受体主要是甘露糖单体或三聚体，而P菌毛受体则是P血清特异性抗原鞘糖脂（P－blood group antigen－specific glycosphingolipids），其主要是α－D－Galp－O－45β－D－Glap碳水化合物序列，P菌毛也是因此而得名。P菌毛因含有多变的结构中心域而具有不同的血清型，但有研究发现，各血清型菌株P型菌毛基因结构具有较高的同源性[18－19]。因含P菌毛的典型菌株是从尿道分离出来的，所以将编码P菌毛的基因命名为pap基因或肾盂肾炎相关纤毛基因（pyelonephritisassociated pili genes）。

利用菌毛起源模型分析，从临床分离出表达P菌毛的染色体，并证实染色体上pap基因簇包含了11个编码P菌毛的基因组[20]。在编码P菌毛的11个基因组中，papA基因是P菌毛单体的主要结构基因，其编码的PapA蛋白为右螺旋蛋白。通过免疫电子显微镜观察到，PapA是P菌毛的主要成分，占菌毛质量的99.9%。除PapA外，P菌毛还含少量的PapE、PapF以及PapG，其中后3种蛋白位于菌毛的尖端。PapF和PapG是黏附素的必要成分。PapG是特殊糖基黏附素，位于P菌毛丝状纤维尖端，能够介导P菌毛黏附素与Galα（1～4）Gal受体决定因子之间的结合或者使黏附素与肾细胞中的一系列球形糖脂相结合。PapG识别糖基化受体是触发肾盂肾炎的前提条件。PapD分子伴侣产物与每一种菌毛蛋白亚单位相互作用形成有活力的复合物，是P菌毛生物合成中PapC外膜组装蛋白的目标复合物。PapH能终止PapA蛋白的聚合，使菌毛与细胞结合到一起。PapE形成一种叫做尖端丝状纤维的开放式螺旋纤维。P菌毛通过PapG黏附素发挥黏附作用，PapG黏附素有3种分子变异型，分别是PapGⅠ ，PapGⅡ，PapGⅢ[21]。Lane M 等[22]研究不同动物获得型尿路感染时发现，P菌毛的作用是可以改变的，特别是PapGⅡ。分子流行病学研究表明，PapGⅢ的等位基因通常是导致可变体发生的先决条件；同时，Pap GⅡ与菌血症有关。Frendeus B等[23]的研究表明，P菌毛能够利用通用类受体－4（TLR4）依赖性途径触发黏膜炎症反应。进一步研究表明，P菌毛有作为候选疫苗的潜能，并已有对P菌毛作疫苗进行免疫接种后相关结果的报道。

2.3 Curli菌毛黏附素

Curli菌毛被提议作为第三类大肠埃希菌表面附着物。Curli菌毛表面蜷曲结构是由一种单一的结构组成，能够结合以下几种血浆蛋白，如纤连蛋白、层黏连蛋白、血蛋白溶解酶原和组织纤溶酶原活化剂以及H激肽原。近来，研究者们已经开始探索Curli菌毛在APEC感染中的作用，认为血细胞凝集素，纤连蛋白及Curli菌毛在APEC菌株中共同表达是Curli菌毛致病的有力证据，同时还认为血细胞凝集素和纤连蛋白是致病性大肠埃希菌黏附宿主表面细胞的重要毒力因子，与菌血症细菌早期定植有关[24－25]。此外，Curli菌毛蛋白不同于所有已知的菌毛蛋白。研究发现从病鸡中分离的大肠埃希菌99%都含有合成Curli菌毛的csgA基因，但因缺乏可识别的信号肽，所以只有部分宿主能够组装并表达Curli菌毛蛋白。

编码Curli菌毛的基因位于csg（Curli菌毛蛋白亚单位基因）基因组中，由两种不同的转录操纵子组成。一个转录操纵子编码csgA，csgB和csgC，另一个编码csgD，csgE和csgG，合成curli菌毛需要两种操纵子同时表达。在大肠埃希菌中，Curli菌毛主要由csgA编码，其编码的蛋白Csg A大小为15 ku。Curli菌毛的组装是Csg A蛋白细胞外的自组装，且在组装过程中需要依靠一种特殊核蛋白CsgB的协助。CsgD是Curli菌毛两种操纵子表达所必须的转录活化剂，CsgG是维持CsgA和CsgB胞外稳定的外膜脂蛋白。Curli菌毛编码基因的表达较复杂，涉及几种调节因子，如 H－NS（histone－like nucleoid structuring protein，组蛋白样类核结构蛋白）、RpoS（RNA polymerase Sigma S Subunit，又作σS，一种RNA聚合酶σ因子亚单位）、OmpR（outer membrane protein regulators，外膜蛋白调节子）以及 MIrA[MerR（mercury resistance regulator）－like regulator A][26－27]。在体外试验中，Curli菌毛是细菌内化造成禽败血症的必需物质，其与P菌毛在禽败血症中的协同作用还需进一步研究。

2.4 温度敏感型血细胞凝集素——Tsh黏附素

Provence D L等[28]首次在 APEC O78：K80菌株甘露糖血凝抑制试验中发现，细菌在26℃培养时，血细胞凝集活性最强；37℃培养，凝集活性降低；42℃高温时，则完全失活。他们把这种对温度有强烈依赖性的凝集因子命名为温度敏感型血细胞凝集素（temperature－sensitive haemagglutinin，Tsh），并确定其编码基因为tsh。有试验证明致病性大肠埃希菌比非致病性大肠埃希菌携带tsh基因的概率要高。研究发现禽致病性大肠埃希菌（E.coli）K－12菌株包含重组的tsh基因，能够合成两种蛋白，即106 ku的细胞外蛋白和33ku的外膜蛋白，可以凝集鸡的红细胞。近一步研究发现，Tsh刚合成时是一个大小为140ku的前体蛋白，在对其加工过程中产生了106ku的分泌蛋白和33ku的β管状外膜蛋白[29]。纯化的Tsh有黏附红细胞，血红蛋白，细胞外基质蛋白，纤连蛋白和胶原蛋白Ⅳ的特性，与蛋白沉积有关，可加速细菌的定植速率。通过对Tsh阳性菌株的检测，进一步证实Tsh与纤维蛋白沉积及气囊损伤有关，且Tsh能提高大肠埃希菌在气囊的定殖速率。同时还发现tsh基因与大肠埃希菌素Ⅴ（colicinⅤ）的基因发生连锁，常常由同一个质粒编码表达。Claudie B等[30]也发现tsh和iss（increased serum survival protein）共同存在于同一个转移质粒上，甚至将是否存在tsh和iss基因作为判定APEC的依 据。但 Dai J J等[31]也 证 实 在 APEC 的IMT5155菌株中Tsh的编码基因位于染色体上，是一种自动转运蛋白家族基因成员，与免疫球蛋白IgA有50%的相似性。温度敏感型血细胞凝集素Tsh是一种新近发现的重要黏附素，其致病作用和编码基因之间的相互作用还不清楚，有待科研工作者的进一步研究。

3 黏附素受体

3.1 糖蛋白或糖脂受体

多数禽致病性大肠埃希菌宿主细胞表面黏附素受体是糖蛋白或糖脂，大部分糖蛋白是由寡糖链通过N糖苷键与天冬氨酸相连或以O糖苷键与丝氨酸或苏氨酸相连构成，糖脂通常是一个亲水寡糖链与疏水酰基构成的糖神经鞘脂，而受体特异性部位往往就是其中的糖类残基。如Ⅰ型菌毛的特异受体就是含D甘露糖残基（D mannoside）的甘露糖单体和三体以及部分糖蛋白禽类呼吸道上皮细胞和部分内脏基质细胞。

3.2 细胞外基质受体

部分黏附素的受体是机体内细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的成分，如胶原蛋白、粘连蛋白、纤维蛋白原（fibrinogen，Fgn）等。

如P菌毛，P菌毛的受体是特异性P血清抗原鞘糖脂，P菌毛中的papE和papF两个成分均可与粘连蛋白（fibronectin，Fn）结合 。由于Curli菌毛其与细菌内化和败血症有关，因此其受体就是血管中的各种血浆蛋白和基质。Tsh黏附鸡的红细胞，所以其受体为鸡的血红蛋白，另外研究还发现，Tsh也黏附粘连蛋白和胶原蛋白Ⅳ。黏附素和受体分子的结合是在三级结构上的配对，受体分子具有种属和组织特异性，因而黏附素也具有种属和组织特异性。

4 影响黏附素黏附的因素

黏附素黏附细胞的过程较复杂，易受各种内外环境因素的影响。主要影响因素如下：细菌的动力，细菌运动情况主要决定黏附素与受体间的接触机会；局部分泌性抗体，如特异性抗菌毛抗体或其他黏附素分泌性抗体具有一定的阻断作用，主要为sI－gA；黏附素受体类似物，细菌黏附素受体类似物可竞争性地与细胞表面的细菌黏附素受体结合，从而抑制黏附素的黏附作用；局部正常菌群，局部正常菌群具有抗黏附作用，其主要是通过局部正常菌群的空间占位作用及其所含有的黏附素类似物对细胞表面受体的封闭作用来完成；其他因素，如温度、离子浓度等。培养温度可影响细菌黏附素的表达，同时细菌发生黏附时的环境温度也可通过对细菌动力等的影响而改变细菌的黏附率。细菌发生黏附时的离子浓度，特别是二价阳离子浓度对黏附结果有明显的影响，其对细菌黏附的促进作用不但取决于电荷的多少，而且取决于离子的大小，一般认为电荷可能在黏附素与其受体相互结合过程中起离子桥作用。

5 展望

有关禽致病性大肠埃希菌黏附素的研究从未间断，但仍有很多未知或知之不多的领域，如黏附及黏附素产生机理、黏附素与细菌毒力关系、黏附素的检测方法等等，有待进一步研究。可以预料的是，从分子角度深入研究禽致病性大肠埃希菌黏附素的组成及致病机理，可以为阐明大肠埃希菌的致病机制，研发新型疫苗，控制和预防禽大肠杆菌病提供依据。但由于黏附素的种类繁多，致病机理复杂，要发展快速有效的诊断方法及制造安全有效的疫苗仍然任重道远。

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