食品过敏原体外检测方法研究进展

孙秀兰，管 露，单晓红，张银志

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

食物过敏（或称食物的超敏反应）其实就是食物引起机体免疫系统的异常反应，更确切的说，是由食物中的过敏原所引起的[1]。食物过敏原指的是能引起免疫反应的食物抗原分子。由免疫介导的食物过敏反应一般为IgE介导[1]。过敏食物分为常见和不常见两大类，联合国粮食与农业组织（FAO）1995年公布的8种常见的过敏食物，分别为牛奶、鸡蛋、鱼、甲壳类（虾、蟹、龙虾）、花生、大豆、核果类（杏、板栗、腰果等）及小麦，约占食物致敏原的90%以上[2]。

食物过敏反应可影响呼吸系统、胃肠系统、中枢神经系统、皮肤、肌肉和骨骼等，有时可能产生过敏性休克，甚至危及生命，因此对食物过敏原的检测是非常有必要的。同时食物过敏问题又因人而异，不仅存在致敏原种类的差异，而且存在量的差异，有时极少量的过敏原蛋白即可引起严重的过敏反应，因此这对食物过敏原蛋白定量检测的灵敏度和准确性提出了更高的要求。

现阶段食物过敏原的检测方法主要包括两大类：体内检测和体外检测[3]。狭义的体内检测就是应用各种变应原为患者进行皮肤试验，观察患者出现反应的时间和程度，从而判断受试者对该种物质是否过敏[4]。其主要包括皮内试验检测法、点刺试验检测法、划痕试验检测法和斑贴试验检测法等，这类方法比较古老，试验部位在患者皮肤，对受试者会造成一定痛苦；而且这些实验均非绝对正确，其中有很多因素影响反应结果的可靠性，易出现假阳性和假阴性反应；另外体内检测容易导致患者产生全身过敏反应，从而存在一定的安全风险。而广义的体内检测除了包括皮肤试验外，还包括食物激发试验，如双盲对照食物激发实验（Double-blinded placebo-controlled food challenges，DBPCFC）[5]。在这类试验中，最重要的就是要控制安慰剂和试验的剂量，以能掩盖食物的气味、质地，并尽量消除被检食物与安慰剂的细微差别。但这样就可能限制了食物的试验剂量，同时其结果也受多因素影响，甚至包括心理反应。

而体外检测是取患者血液或其他可代替的体液，亦或是其中的某些特异性成分来进行的离体检测，过敏原并不直接应用于人体。故其在安全性和影响因素方面都比体内检测要更胜一筹，因此近年来这方面的研究越来越多。以下就体外检测的一些方法分别加以简介。

1 免疫分析检测技术

目前，体外检测过敏原的方法主要是免疫分析技术[1]，它是将免疫反应与现代检测手段相结合而建立的超微量测定技术，是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术，突出特点是高度的准确性和特异性。

1.1 利用人血清特异性IgE检测食品过敏原

过敏患者的血清含有可与过敏原特异性结合的抗体，主要是IgE。利用人血清来检测食物中的过敏原主要就是应用血清中的抗体来检测相应的抗原。这类方法一般用于临床检测。

1.1.1 RAST抑制试验和EAST抑制试验

在体外过敏原检测试验中，放射过敏原吸附抑制试验（Radio allergosorbent test inhibition，RAST抑制试验）和酶标记过敏原吸附抑制试验技术（Enzyme linked allergosorbent assays inhibition，EAST抑制试验）[6]是目前国际上变态反应临床及科研人员使用最广泛、最灵敏的方法，也是评价过敏原总致敏活性的关键技术。其优点是该方法的灵敏性和准确性高，同时解决了不同食品过敏原的交叉致敏问题。但RAST和EAST抑制试验的一个主要不足是对人血清的依赖性，由于血清难以保证一致，即同一性差，因而这两种方法难以标准化。

1.1.2 免疫印迹（Western blotting）

免疫印迹法[7]（Western blotting）是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。其采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用酶标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的、特异性的目的蛋白。

Satoh等从转基因大米和非转基因大米中提取盐溶蛋白，用过敏患者的血清进行Western blotting分析，结果显示两种大米中蛋白种类几乎无差别，也没有检测到已知的或新的特异性IgE结合蛋白，表明被检的两种大米中都无过敏原[8]。吴序栎等采用了10位牛奶过敏患者的混合血清，来鉴定牛奶粗提液中的过敏原，发现了致敏原的分子质量为34和14 ku[9]。杨睿等用鱼过敏患者检测出了带鱼中的重要过敏原蛋白，其中在分子质量大小为54 ku处的蛋白印迹阳性率为100%，38 ku处的阳性率为90%，27、34 ku处的阳性率为70%[10]。

免疫印记实验已成为现今过敏原鉴定的主要方法之一。同时也有人对其做了些许改进，即不使用过敏患者的血清，如蒋红玲等就使用免疫小鼠的血清作为一抗，来检测脱脂乳浸液中的过敏原[11]；You等使用杂交瘤细胞培养液中单克隆抗体作为一抗，来检验大豆β-伴大豆球蛋白提取液中的过敏原[12]。改善后的免疫印迹法消除了对人血清的依赖性。

1.1.3 其他

临床上还用到琼脂凝胶双扩散法[4]和对流免疫电泳等体外检测技术[4]。琼脂凝胶双扩散又称为免疫双扩散，其原理是免疫沉淀反应剂中的抗原抗体，在含有电解质的琼脂凝胶中，可以向周围自由扩散，当抗原抗体扩散到适当的部位而相遇时，则可生成肉眼可见的线性沉淀物—特异性抗原抗体结合物。对流免疫电泳法是在免疫双扩散的基础上发展起来的一种检测方法，它利用琼脂电泳时产生的电渗现象，使血清中免疫球蛋白向负极移动，与加在负极而向正极移动的抗原相遇，形成复合物而沉积下来，若浓度合适，则会形成肉眼可见的沉淀线。

利用人血清特异性IgE来检测过敏原的这类方法很直观、简单，且特异性强，但并不适合食品过敏原的可靠检测，因为血清中的IgE具有特异性，只针对被提取者，而且所提取血清的量也有限。此外，血清中的免疫球蛋白不单只有IgE一种，每种免疫球蛋白都可能对多种过敏原存在交叉反应。

1.2 用单克隆抗体或多克隆抗体检测食品过敏原

为了克服用人血清IgE抗体检测食品过敏原的不足，依赖于如兔、鼠、绵羊、山羊、鸡等动物抗血清的免疫分析方法逐渐发展起来。这些抗体检测激发免疫作用抗原的效果要比人血清好，且比较易得。

1.2.1 免疫层析法

免疫层析法[13]（Immunochromatography）是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

Puerta等运用夹心酶标免疫亲和层析法（ELIAC）检测市售低致敏婴儿配方食品中的β-乳球蛋白和其致敏肽段，β-乳球蛋白在pM到μM的水平上都可以被检出[14]，而分子质量低于3 000的β-乳球蛋白肽段也显示出过敏原性，可见该方法是很灵敏的。

免疫层析法中免疫胶体金标记技术（Immunogold labeling technique）[15]的应用较为广泛。其是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。利用胶体金在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团借静电吸引而形成牢固结合。金颗粒具有高电子密度的特性，在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，可用于定量或半定量。依据双抗夹心ELISA法，吉坤美等把胶体金-抗花生总蛋白抗体固定于吸水纤维部分，待测花生过敏原与胶体金-抗花生总蛋白抗体形成复合物，被包被在硝化纤维膜检测线上的鼠抗花生总蛋白抗体捕获浓集成红色，可检测花生的主要过敏原组分Ara h 1与Ara h 2，灵敏度达50 ng·mL-1[16]。另外，该研究组还应用建立的免疫层析法对食物标签标注的含有花生成分、未含花生成分以及标注不详的19种食品进行了检测。结果发现17种食品的检测结果与食物标签的内容相符合,2种标示不详的食品检测结果均为阳性，说明该方法特异性强，对于是否含有花生过敏原成分的食物检测具有实际应用价值。

由于免疫层析技术特异性强、灵敏度高，近年来，其在食物过敏原检测中得到了快速发展，但多集中在花生、榛子等坚果类过敏原的研究。另外，免疫层析检测试纸条也进入市场，加入了快检的行列。但该技术多为定性或半定量检测，有待于进一步的发展。

1.2.2 酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是一种将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合的免疫分析方法，其检测特异性源于抗原与抗体之间的特异性反应。ELISA的分类方法众多，主要有双抗体夹心法、间接法、捕获法和竞争法，其中，双抗夹心ELISA法和竞争ELISA法应用最为广泛。

Jeoung等用双抗夹心ELISA法来定量褐虾的主要过敏原Pen a 1（原肌球蛋白）[17]。实验中采用了两种针对Pen a 1不同表位的特异性单克隆抗体，其中一种作为包被抗体，而另一种则连接生物素用以检测，结果检测到的Pen a 1的线性范围在4～125 ng·mL-1。You等应用竞争ELISA法测定大豆及其产品中的β-伴大豆球蛋白[12]。其用相当于β-伴大豆球蛋白一个表位的合成肽与牛血清白蛋白的复合物作为包被抗原，以单克隆抗体作为一抗与之结合，测得的IC50值为4.7 ng·mL-1，检测限为2.0 ng·mL-1，同时β-伴大豆球蛋白的回收试验也表现出良好的重现性。张在军等[18]利用斑点ELISA法（Dot-ELISA）对花生、虾和鸡蛋清中过敏原的检测进行了研究，结果发现Dot-ELISA法可以同时测定多种过敏原，且具有简便、快速、特异、灵敏、重复性好、成本低等优点。

近年来，市场上已有多种商品化的过敏原检测ELISA试剂盒销售，这些试剂盒可在短时间内实现过敏原的定性和半定量检测。ELISA法灵敏性高、特异性强、快速、费用低，因而在过敏原检测中得到了广泛的应用，特别适用于食物中少量存在就能引起严重过敏症状的过敏原检测。但其局限性在于食品在处理过程中可能会引起蛋白成分的破坏，而导致ELISA法假阴性的出现。

1.2.3 荧光免疫检测

荧光免疫检测是ELISA方法的延伸，只是在物质分析中采用荧光信号，荧光信号发生物主要是异硫氰酸酯和罗丹明。荧光免疫检测的种类很多，但近年来时间分辨荧光免疫检测（TRFIA）使用得更为广泛，其是20世纪80年代迅速发展起来的的一种公认的最有发展前途的非放射免疫标记技术。

TRFIA[19]是用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，与其螯合剂、增强液（有些不需要）在待反应体系（如抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等）发生反应后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度比值，推测反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。

刘志刚等建立了双抗夹心时间分辨荧光免疫法来测定食品中花生过敏原蛋白成分[19]。其用Eu3+标记链霉亲和素，并以β-二酮体作为增强剂，发现该方法特异性强，最低检出限为0.1 ng·mL-1，在0.1～160 ng·mL-1范围内线性良好。Faste等用时间分辨荧光免疫法来检测食品中的榛子蛋白，其用铕的螯合物的荧光特性来提高信噪比，以降低基质干扰和提高灵敏度[20]。该方法适用于痕量分析，其检测限达0.1 mg·mL-1，定量限为0.33 mg·mL-1，在饼干和谷类食品中的回收率为73%～123%，在巧克力中的回收率为50%～77%。另外该研究组还用此方法测了挪威市售的标有“可能含榛子”的100种食品，其中有36种榛子蛋白含量小于0.2 mg·kg-1，有7种含量超过10 mg·kg-1。

时间分辨荧光免疫法是一种高度灵敏的免疫分析技术，具有检测范围宽、对标记物分子生物活性影响小、无放射性污染、标记物保存时间长等优点。适合于生物学、医学等超微量分析，目前已经推出几十种商品化的试剂盒。

1.2.4 免疫传感器检测技术

免疫传感器技术[21]是将传统的免疫测试结果通过传感器转换为精密的数字输出，不但能达到定量检测的效果，还能实时监测到表面的抗原抗体反应。免疫传感器技术具有方便、省时、精度高、便于计算机收集和处理数据等优点，又不会或很少损伤样品和造成污染，易于推广普及。

Liu等制备了电化学免疫传感器来检测花生过敏原的抗体，测定方法用到了安培测定和EIS检测[22]。该方法检测限达5 pg·mL-1，IgY浓度为5 pg·mL-1到1 μg·mL-1范围内线性较好。沈丽燕用1，6-己二硫醇（HDT）-纳米金自主装金电极，包被IgE抗体后制成压电免疫传感器，检测花生跟河虾中的过敏原[23]，结果显示，河虾蛋白的最低检测限为0.03 μg·mL-1，花生蛋白的最低检测限为0.2 μg·mL-1，表明该传感器具有较高的灵敏度。宁炜也应用这种自主装的压电免疫传感器对花生和河虾过敏原进行了同步筛检，实验证明该方法回收率高，重现性好[24]。

目前免疫传感器正处于快速研发阶段，电极表面的自主装材料也是一个发展方向，汪忠云[26]将四乙氧基硅在盐酸催化下水解形成的硅溶胶、离子液体和黄曲霉毒素B1（AFB1）抗体混合后涂于玻碳电极表面制成非标记型抗体免疫传感器。此外还有很多研究者都在探索新的、更好的自主装材料，比如磁小体[27-28]就有可能成为一种新型的耦合载体，以及石墨烯[29]、量子点[30]、碳纳米管[30]等纳米材料都已被开发加以运用。

2 非免疫分析检测技术

2.1 PCR检测

DNA比蛋白质的稳定性高，在食品加工中更耐加热和加压处理，且只要有微量的目的基因就可以扩增出高于检测限的含量，因此PCR检测方法可以克服蛋白含量低而被食品基质掩盖的缺点。同时DNA的特异性也较高，因此PCR可以用于一些过敏原含量低或者成分复杂的食品的检测。

Torp等采用半定量PCR方法来检测大豆过敏原Gly m Bd 30k的DNA序列，该方法的检测限达到0.01%[28]。Galan等用实时定量PCR法同时检测加工食品中羽扇豆和大豆的线粒体DNA，并将其作为过敏原的存在标志[29]。实验发现该方法产生的结果具有一致性和可重复性，特异性较高，且其灵敏度适于过敏成分含量在较低的mg·kg-1范围内的食品。史艳宇等也采用实时荧光PCR方法来检测食品中的痕量荞麦成分，发现该方法能有效而快速地进行检测，且特异性强，灵敏度高[30]。

PCR方法灵敏、稳定性好，检测速度较快，但其不足之处在于PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后，紫外光观察结果，或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，需要多种仪器，实验过程繁杂，更重要的是容易造成污染和出现假阳性的结果。

2.2 质谱技术

质谱技术（Mass spectrometry）主要是针对分子间的非共价键反应如抗原抗体间的特异性结合进行分析，其具有灵敏度高、样品用量少、分析速度快、分离和鉴定同时进行等优点，已得到广泛的应用。该技术可用于过敏原表位的定位，也可用过过敏原的定量测定。宋益银等对锯缘青蟹中的过敏原进行MALDI-TOF/TOF-MS检测[31]，发现其中两个肽段有酪蛋白激酶Ⅱ和蛋白激酶C的磷酸化位点，是过敏原参与机体反应的重要活性位点。Webe等使用同位素标记酪蛋白肽段，通过质谱分析，在饼干中可定量检测出1.25 μg·g-1的酪蛋白[32]。但质谱分析必须要有专门的仪器来进行检测，且其样品处理比较繁琐。

2.3 其他

生物芯片技术是通过缩微技术，根据分子间特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。目前，生物芯片技术逐渐进入了食品安全检测领域，用于过敏原检测的生物芯片主要是蛋白质芯片，利用荧光标记的灵敏性和抗原抗体结合的特异性来实现检测。Harwanegg等建立了以生物芯片免疫分析为基础的过敏原微阵列技术，对鸡蛋、牛奶特异性IgE进行检测[33]。Lin等应用牛奶过敏蛋白肽段，建立了一个可靠、敏感的肽微阵列免疫检测技术，以得到大量食物过敏原的表征图谱[34]。生物芯片技术应用于食品安全检测，具有快速、微型化、自动化、高通量、高特异性、高灵敏度等优点；但是，检测成本高，芯片上多种探针的存在容易造成假阳性的结果。尽管存在诸多问题，其发展前景仍然十分广阔[35-36]。

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图，是一种综合的、可量化的鉴定手段。吴海强等首次提出将指纹图谱应用到食品过敏原的快速检测分析[37-39]，他们提取鱼、河虾、花生中的过敏原总蛋白，进行2-DE指纹图谱分析，从而确定了食品过敏原指纹图谱快速检测的可行性，为进一步鉴定过敏原提供基础。

3 展 望

食品过敏原的检测已经逐渐成为食品安全检测的一个热点问题，相关的检测技术也在不断的发展，目前常用的检测方法都各有其优点和不足，而将数种检测方法相结合，则能更为有效地检测食品中常见的过敏原甚至是潜在的过敏原。Chassaigne等用荧光二维微分凝胶电泳、western blotting以及Q-TOF质谱联合对花生提取液中的过敏原进行分析，鉴定出花生过敏原Ara h 1、Ara h 2以及Ara h 3/4[40]。Bettazzi等结合DNA芯片技术和PCR技术来检测榛子中的过敏原[41]。本文也将会结合ELISA、PCR、免疫传感器等方法建立食品中过敏原的评价模式，来检测鱼、牛奶、大豆、鸡蛋中的过敏原，以期实现准确、安全、快速、高灵敏的检测。

此外，随着贸易全球化的发展，不同地域间食物的相互流通以及深加工技术的广泛应用，使得过敏人群接触食物中过敏原的种类日益增多，因此开发高通量、高灵敏度以及快速的食品过敏原检测方法也势在必行。

[1]胥传来.食品免疫学[M].北京:化学工业出版社,2007:121-150.

[2]FAO.Report of the FAO Technical Consultation on Food Allergies[C].Rome:Food and Agriculture Organization,1995.

[3]Lars K.Poulsen.In vivo and in vitro techniques to determine the biological activity of food allergens[J].Journal of Chromatography B,2001,756:41-55.

[4]乔秉善.变态反应学实验技术[M].北京:中国协和医科大学出版社,2002:103-144.

[5]Matthias Besler.Determination of allergen in foods[J].Trends in Analytical Chemistry,2001,20(11):662-672.

[6]Graham Roberts,D M,Lack G,et al.Diagnosing peanut allergy with skin prick and specific IgE testing[J].J Allergy Clin Immunol,2005,115(6):1291-1296.

[7]Biji T.Kurien,R.Scofield H.Western blotting[J].Methods,2006,38:283-293.

[8]Satoh R,Nakamura R,Komatsu A,et al.Proteomic analysis of known and candidate rice allergens between non-transgenic and transgenic plants[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology,2011,59:437-444.

[9]吴序栎,袁小平,刘志刚,等.牛奶过敏原的分离、鉴定与纯化[J].中国乳品工业,2008,36(12):15-17.

[10]杨睿,吴海强,刘志刚,等.带鱼过敏原的分离、鉴定与纯化[J].热带医学杂志,2008,8(11):1112-1115.

[11]蒋红玲,向军检,王宏,等.牛奶中过敏原组分的分离纯化及主要过敏原的鉴定[J].暨南大学学报:医学版,2008,29(4):341-346.

[12]You J M,Li D F,Qi S Y,et al.Development of a monoclonal antibody-based competitive ELISA for detection ofβ-conglycinin,an allergen from soybean[J].Food Chemistry,2008,106:352-360.

[13]Ono T,Kawamura M,Arao S,et al.A highly sensitive quantitative immunochromatography assay for antigen-specific IgE[J].Journal of Immunological Methods,2003,272:211-218.

[14]Puerta A,Diez-Masa J C,de Frutos M.Immunochromatographic determination of β-lactoglobulin and its antigenic peptides in hypoallergenic formulas[J].International Dairy Journal,2006,16:406-414.

[15]Hiemori M,Ito H,Kimoto M,et al.Identification of the 23-ku peptide derived from the precursor of Gly m Bd 28K,a major soybean allergen,as a new allergen[J].Biochimica et Bio-physica Acta,2004,1675:174-183.

[16]吉坤美,陈家杰,詹群珊,等.胶体金免疫层析法检测食品中花生过敏原蛋白成分[J].食品研究与开发,2009,30(5):101-105.

[17]Byeoung-Ju Jeoung,Reese G,Hauck P,et al.Quan-tification of the major brown shrimp allergen Pen a 1(tropomyosin)by a monoclonal antibody-based sandwich ELISA[J].J Allergy Clin Immunol,1997,100(2):229-234.

[18]张在军,毛露甜,向军检,等.Dot-ELISA法同时检测多种食品过敏原的实验研究[J].食品科技,2005(4):69-74.

[19]刘志刚,李佳娜,顾耀亮,等.时间分辨免疫荧光法测定食物中花生过敏原成分[J].食品科技,2010,35(2):241-245.

[20]Faeste C K,Holden L,Plassen C,et al.Sensitive time-resolved fluoroimmunoassay for the detection of hazelnut(Corylus avellana)protein traces in food matrices[J].Journal of Immunological Methods,2006,314:114-122.

[21]Yin Huang,Melissa C.Bell,Ian I.Suni.Impedance Biosensor for Peanut Protein Ara h 1[J].Anal Chem,2008,80:9157-9161.

[22]Hongyun Liu,Ruchika Malhotra,Mark W Peczuh,et al.Electrochemical immunosensors for antibodies to peanut allergy ara h2 using gold nanoparticle-peptide films[J].Anal Chem.2010,82:5865-5871.

[23]沈丽燕.食品过敏原压电型免疫传感快速检测技术的研究[D].无锡:江南大学,2008.

[24]宁炜.花生、河虾过敏原抗体的制备及压电免疫传感同步检测[D].无锡:江南大学,2009.

[25]汪忠云.离子液体介导免疫传感器的研制[D].无锡:江南大学,2009.

[26]Matsunaga T,Ueki F,Obata K,et al.Fully automated immunoassay system of endocrine disrupting chemicals using monoclonal antibodies chemically conjugated to bacterial magnetic particles[J].Anal Chem Acta,2003,475:75-83.

[27]Kuhara M,Takeyama H,Tanaka T,et al.Magnetic cell separation using antibody binding with protein A expressed on bacterial magnetic particles[J].Anal Chem,2004,76:6207-6213.

[28]Torp A M,Olesen A,Sten E,et al.Specific,semi-quantitative detection of the soybean allergen Gly m Bd 30K DNA by PCR[J].Food Control,2006,17:30-36.

[29]Antonio M.Gomez Galan,Marcel Brohee,Eugenia de Andrade Silva,et al.Development of a real-time PCR method for the simultaneous detection of soya and lupin mitochondrial DNA as markers for the presence of allergens in processed food[J].Food Chemistry,2011,127:834-841.

[30]史艳宇,刘金华,逄晓阳,等.实时荧光PCR方法检测食品中痕量荞麦成分[J].食品科学,2009,30(20):312-315.

[31]宋益银,林蕾,苏秀榕,等.锯缘青蟹(Scylla serrata)特异性过敏原的研究[J].海洋与湖沼,2009,40(1):62-67.

[32]Weber D,Raymond P,Ben Rejeb S,et al.Development of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method using capillary liquid chromatography and nanoelectrospray ionizationquadrupole time-of-flight hybrid mass spectrometer for the detection of milk allergens[J].J Agric Food Chem,2006,54(5):1604-1610.

[33]Harwanegg C,Hutter S,Hiller R.Allergen microarrays for the diagnosis of specific IgE against components of cow's milk and hen's egg in a multiplex biochip-based immunoassay[J].Methods Mol Biol,2007,385(1):145-157.

[34]Jing Lin,Ludmilla Bardina,Wayne G.Shreffler,et al.Development of a novel peptide microarray for large-scale epitope mapping of food allergens[J].J Allergen Clin Immunol,2009,124(2):315-322.

[35]Roy S,Sen C K.cDNA microarray screening in food safety[J].Toxicology,2006,3(1):128-133.

[36]Liu-Stratton Y,Roy S,Sen C K.DNA microarray technology in nutraceutical and food safety[J].Toxicology,2004,150(1):29-42.

[37]吴海强,余晓,刘志刚.食品过敏原指纹图谱快速检测研究-鲫鱼、鲢鱼总蛋白2-DE指纹图谱分析[J].热带医学杂志,2006,6(1):10-12.

[38]吴海强,余晓,刘志刚.食品过敏原指纹图谱快速检测研究-河虾总蛋白2-DE指纹图谱重现性分析[J].热带医学杂志,2006,6(2):131-134.

[39]吴海强,余晓,刘志刚.食品过敏原指纹图谱快速检测研究-花生总蛋白2-DE指纹图谱和蛋白点MALDI-TOF/MS分析[J].热带医学杂志,2006,6(3):271-274.

[40]Chassaigne H,Tregoat V,Jorgen V,et al.Resolution and identification of major peanut allergens using a combination of fluorescence two-dimensional differential ge electrophoresis,Western blotting and Q-TOF mass spectrometry[J].Journal of Proteomics,2009,72:511-526.

[41]Bettazzi F,Lucarelli F,Palchetti I,et al.Dis-posable electrochemical DNA-array for PCR amplified detection of hazelnut allergens in foodstuffs[J].Analytica Chimica Acta,2008,614:93-102.